猪乳外胞体总miRNAUnit对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制抑制的研究

蔡锦顺， 关立增， 娄鞍钢， 胡　楠

(延边大学农学院，吉林延吉 133002)

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高传染性的疾病，给养猪业造成了巨大的经济损失[1-2]。研究发现，许多miRNA与抑制PRRSV复制也有密切的关系[3]。miRNA是一类小分子非编码单链RNA，大小为18～25 bp，广泛存在于动物和植物中，并作为重要转录后调节因子调控基因的表达[4]。

最近，研究证明miRNA可以通过外胞体(Exosome)进入循环系统而发挥生物学作用[5]。Exosome是一类由细胞通过内吞作用形成直径为30～100 nm的小囊泡，它通过融合细胞内的多泡体而释放到细胞外环境，在细胞间行使信号交流，是一种新型的细胞间信息交流方式[6]。同时，研究发现miRNA可包裹于母乳Exosome中，母畜可以通过乳Exosome将miRNA传递给仔畜，并发挥生物学作用[7]。

目前，关于猪乳Exosome中与抑制PRRSV复制有关的miRNA的研究还未见报道，因此本研究将以延边地区的长白猪为材料，分离猪乳Exosome并提取总miRNA，在细胞水平上验证其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抑制作用。本研究将为PRRS的预防和治疗提供新的理论依据和途径。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1细胞和病毒Marc-145细胞和PRRSV，由延边大学动物传染病实验室保存。

1.1.2主要试剂无水乙醇、CHCl3和异丙醇，购于北京佳兰生物科技公司；Trizol试剂，购于Omega公司；Ribonuclease Inhibitor，购于大连TAKARA公司；DMEM液体培养基、胰蛋白酶和青霉素、链霉素，购于GIBCO公司；胎牛血清，购于浙江杭州四季青生物工程材料有限公司；细胞培养耗材，购于北京佳兰生物科技公司；miRNA提取试剂盒，购于北京佳兰生物科技公司。

1.1.3主要仪器高速大容量冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、紫外/可见光分光光度计(Eppendorf公司)；细胞培养CO2培养箱(Thermo公司)，-80 ℃超低温冰箱(REVCO公司)；普通冰箱(SANYO公司)；倒置生物显微镜(Olympus公司)；分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；超高速离心机(美国贝克曼公司)；超净工作台(江苏苏州净化公司)；超纯水系统(广东广州誉维生物科技仪器有限公司)。

1.2　方法

1.2.1猪乳Exosome的分离收集200～300 mL延边地方长白母猪(6头)分娩后初乳和常乳的混合样，立即放入 -80 ℃ 冰箱储存备。后将-80 ℃冰箱的乳样解冻，3 000 r/min 4 ℃离心40 min，取上清，去掉乳腺细胞碎片和乳脂蛋白等杂质；之后12 000 r/min 4 ℃离心40 min，取上清，进一步去掉乳脂蛋白、酪蛋白和一些细胞碎片；最后 150 000 r/min 4 ℃超高速离心3 h，获得猪乳Exosome。

1.2.2猪乳Exosome中总miRNA的分离根据miRNA提取试剂盒步骤(北京佳兰生物科技公司)进行miRNA提取，最后用核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度，放入-30 ℃备用。

1.2.3细胞水平验证猪乳Exosome对PRRSV复制的影响

1.2.3.1Marc-145细胞的培养从液氮罐中取出保存的Marc-145细胞，迅速放入预热好的37 ℃水浴锅中，反复摇动，使管中液体快速融化。后在离心机中1 500 r/min离心，5 min 后在超净台中吸去上清液，加入1 mL含有10% FBS的DMEM培养基，用玻璃吸管轻轻吹打形成细胞悬液。最后将细胞悬液转移至25 mL细胞培养瓶中，补加含有10% FBS的DMEM培养基至7 mL，放入37 ℃、5% CO2的培养箱内培养。待细胞铺满细胞瓶底后进行传代，在超净台中吸弃旧的培养基，加入2 mL PBS缓冲液洗涤细胞，弃去，然后向细胞瓶中加入1 mL细胞消化液，轻轻摇匀使消化液润到所有细胞，在 37 ℃ 培养箱作用3 min后显微镜下观察，在细胞变圆并有少量细胞脱落漂浮时，立即吸取消化液，加入3 mL含有10% FBS的DMEM培养基，用玻璃吸管反复吹打，使细胞完全脱离瓶底，最后根据细胞的量将细胞转移到新的细胞培养瓶中，补充培养基至5 mL，盖好瓶盖，放入37 ℃、5% CO2的培养箱内培养。

1.2.3.2Exosome对MARC-145的转染按“1.2.3.1”节传代方法将MARC-145细胞传代到6孔细胞培养板上，将铺好细胞小心置于5% CO2细胞培养箱中，当细胞生长至密度约70%时，开始进行转染；取2 mL EP管，加入50 μL DMEM和10 μL Exosome(20 ng/100 μL)，轻微混匀；之后将混合液体加入到MARC-145细胞中，置于5% CO2细胞培养箱中继续培养，另设阴性对照组，阴性对照组所用试剂为PBS，转染过程与前述相同。

1.2.3.3PRRSV的接毒试验和滴度测定按“1.2.3.2”节方法进行Exosome转染24 h后，加入MOI为0.5的PRRSV病毒液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中24、48 h，收集上清，进行病毒滴度测定。取出细胞瓶，-20 ℃反复冻融3～4次，转移细胞培养物至大离心管中，3 000 r/min离心5 min收集上清液，将收集得到病毒悬液，以10倍稀释(10-1～10-8)后，将各稀释度的病毒液接种于96孔板中的MARC-145细胞，按Reed-Muench的方法进行病毒TCID50滴度测定。同时，在96 h后利用倒置显微镜进行细胞病变效应观察。

1.2.4细胞水平验证猪乳Exosome中总miRNA对PRRSV病毒复制的影响

1.2.4.1Marc-145细胞的培养细胞的培养方法见“1.2.3.1”节。

1.2.4.2总miRNA对MARC-145的转染取2.0 mL EP管，加入不含血清的DMEM和500 ng的总miRNA，配制成miRNA终浓度为50 nmol/L的混合液，之后按“1.2.3.2”节方法进行转染。之后将混合液体加入到MARC-145细胞中，置于5% CO2细胞培养箱中继续培养，另设阴性对照组，试剂采用PBS。

1.2.4.3PRRSV接毒试验和滴度测定PRRSV接毒试验和滴度测定方法同“1.2.3.3”节。

2　结果与分析

2.1　猪乳Exosome对PRRSV病毒复制抑制结果

本试验在6孔板上对MARC-145细胞进行培养，之后用Exosome和PBS进行转染，24 h后感染PRRSV，并在PRRSV感染后24、48 h时收集上清，测定其TCID50。结果表明，转染猪乳Exosome细胞中的PRRSV滴度显著低于转染PBS(阴性对照)细胞中的PRRSV滴度。结果初步说明猪乳Exosome对PRRSV的复制起到了抑制作用(图1)。

同时，本试验在MARC-145细胞上接种PRRSV 96 h后，在显微镜下对MARC-145细胞的形态进行观察。由图2、图3可知，猪乳Exosome组中MARC-145细胞的形态仍呈不规则的多边形，排列较紧密，边缘较清晰整齐。而阴性对照组(PBS组)中MARC-145细胞形态消失，皱缩、塌陷，边缘不清晰，贴壁细胞出现灶状聚集，大量细胞脱落悬浮。进一步说明，猪乳Exosome抑制了PRRSV在Marc-145细胞上产生的病变反应。证明猪乳Exosome与抑制PRRSV复制有密切的关系。

2.2　猪乳Exosome中总miRNA对PRRSV病毒复制抑制结果

本试验对猪乳Exosome总miRNA进行进一步提取，同样按上述方法在6孔板对MARC-145细胞进行培养，后用提取的总miRNA和PBS对细胞进行转染，24 h后感染PRRSV，分别在24、48 h时收集上清，测定其TCID50。由图4可知，miRNA处理组中的PRRSV滴度显著低于阴性对照组(PBS处理组)的PRRSV滴度，说明猪乳Exosome中的miRNA对PRRSV的复制起抑制作用。

同样本试验在MARC-145细胞上接种PRRSV病毒96 h后，在显微镜下对MARC-145细胞的形态进行观察。由图5、图6可知，miRNA处理组中MARC-145细胞的形态仍呈不规则的多边形，排列较紧密，边缘较清晰整齐；而阴性对照组(PBS处理组)中MARC-145细胞形态开始变形或消失，细胞边缘不清晰，贴壁细胞出现灶状聚集，大量细胞脱落悬浮。此结果也进一步说明，猪乳Exosome中的某些miRNA抑制了PRRSV在Marc-145细胞上产生的病变反应。证明猪乳Exosome中存在与抑制PRRSV复制有密切的关系miRNA。

3　结论与讨论

miRNA对病毒调节作用是人们广泛关注的热点之一，其实miRNA几乎参与调控了各个领域的所有细胞生命活动的发生[4]。成熟的miRNA一般是长度约为22 bp单链RNA，成熟的miRNA与RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，然后与靶基因的3′端非编码区(3′-UTR)互补，调节基因表达，发挥相应的调节功能[8]。miRNA从发现开始就受到病毒学研究者的高度重视，被认为是抗病毒感染的最有效方法之一。而研究表明，miRNA可包裹于母乳的Exosome中，母猪可以通过乳Exosome将miRNA传递给仔猪并发挥生物学作用[7]。如Zhou等在猪乳外胞体中发现了大量免疫相关的miRNA，这些miRNA约有59种，其中miR-148a、30b、182和200b的丰度排在前10位，并且初乳中的数量要高于常乳，而且可抵抗恶劣的环境[9]。因此，关于乳Exosome中miRNA功能的研究正成为国内外研究的一个新的热点。但关于猪乳Exosome中与抑制PRRSV复制有关的miRNA的研究还未见报道，因此本试验首次对猪乳外胞体总miRNA对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制抑制作用进行了研究。

本试验首先对猪乳Exosome进行提取并在MARC-145细胞上初步验证Exosome是否对PRRSV的复制有抑制作用。通过病毒滴度测定和细胞病变观察，证实Exosome能显著抑制PRRSV的复制。为了验证Exosome对PRRSV复制的抑制是否通过其含有miRNA起作用，本试验对Exosome的miRNA进行了进一步提取，并通过病毒滴度测定和细胞病变观察证实，提取miRNA能显著抑制PRRSV的复制。综合上述，通过猪乳Exosome中miRNA可以抑制PRRSV复制。本试验结果将为下一步采用生物信息学及分子生物学等方法对猪乳Exosome中的具体miRNA的挖掘并进行功能验证、在细胞水平和活体水平上分析具体抑制PRRSV复制的miRNA功能及确定猪乳Exosome中miRNA抑制PRRSV病毒复制的机理提供实验基础，将为PRRS的防治和药物开发提供一个新的思路。

参考文献：

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[9]Zhou Q，Li M，Wang X，et al. Immune-related microRNAs are abundant in breast milk exosomes[J]. International Journal of Biological Sciences，2012，8(1)：118-123.