微波辅助提取资木瓜多酚化合物工艺优化

何冬兰，薛芷筠，张泽文，王　怡，程国军，李晓华，田贞环

(1中南民族大学 湖北省微生物资源与利用工程技术研究中心，武汉 430074；2 宜昌银泽源农业科技有限公司，宜昌 443500)

资木瓜[ChaenomelesSpeciosa(sweet) Nakai]为湖北省长阳资丘特产的皱皮木瓜，又名贴梗海棠，是蔷薇科(Rosaceae)木瓜属(Chaemoneles)的成熟果实[1]，是一种药食价值兼具的水果，民间更是有“杏一益，梨二益，木瓜百益”之说，为湖北省的十大道地药材之一. 资木瓜主要含有有机酸、多酚类化合物、三萜酸、糖、维生素等成分[2-5]. 其中多酚化合物是一类具有独特药效和生理活性的天然产物[6]，大量研究结果表明植物多酚具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤，防治肺动脉高压等作用[7-12]，在美容、制药、医疗等行业极具开发前景，但有关资木瓜多酚的研究以及微波提取工艺的研究目前尚鲜有报道[3]，本实验拟采用微波辅助乙醇提取资木瓜多酚类化合物，在单因素实验结果的基础上采用正交设计，确定资木瓜多酚的最佳提取方法，为资木瓜的深度开发提供依据.

1　实验材料与仪器

1.1　实验材料

资木瓜(产地湖北省宜昌市长阳县榔坪镇)，没食子酸标准品(上海源叶生物科技有限公司，纯度98%)，无水乙醇、钨酸钠、钼酸钠、85%磷酸、浓盐酸、硫酸锂、液溴、碳酸钠均为分析纯.

1.2　实验仪器

FW250中药粉碎机(郑州科丰公司)，MAS-ⅡPLUS常压微波萃取反应工作站(上海新仪公司)，UV-3100BPC分光光度计(上海美谱达公司)，HH-2恒温水浴锅(金坛市科兴仪器厂)，HR/T16MT台式高速冷冻离心机(湖南赫西公司)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHB-3循环水式真空泵(郑州杜甫仪器厂).

2　实验方法

2.1　没食子酸标准曲线的绘制

精确称取0.010 g没食子酸标准品置于烧杯中，加水溶解，转移溶液至100 mL容量瓶，定容至刻度线. 分别吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL上述标准液加入到10 mL的具塞比色管中，添加1 mL制备好的Folin-ciocalteu试剂[13]，充分混匀后，加入2 mL 15%Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至刻度. 室温静置反应2 h，于765 nm处测定吸光度. 以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[14].

2.2　资木瓜多酚的提取与测定

准确称取资木瓜干粉100.00 g，按照料液比1∶10加入95%乙醇，回流2 h，抽滤除去乙醇后，烘干，除去部分色素和脂溶性物质[14]. 准确称取1.0 g脱脂资木瓜干粉，按照一定料液比加入一定体积的乙醇溶液后，一定功率的微波处理一定时间后，提取液在4 ℃、7000 r/min离心10 min后，保留上清液，加入相同体积的乙醇溶液洗涤沉淀，再次离心后合并上清液，减压浓缩，收集残留物，用蒸馏水定容至20 mL. 吸取0.1 mL多酚粗提液于10 mL比色管中，加入Folin-ciocalteu试剂1 mL、15%Na2CO3溶液2 mL，用蒸馏水定容至10 mL，充分混匀后，静置反应2 h，稀释两倍，于765 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算多酚含量.

2.3　单因素实验

微波法提取木瓜过程中，影响多酚最终提取率的因素颇多，本研究着力从微波功率、微波时间、乙醇浓度以及料液比4个方面优化多酚提取工艺，利用单因素实验观察以上4个因素对多酚提取的影响.

2.3.1微波功率对资木瓜多酚得率的影响

称取1.0 g脱脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、乙醇浓度60%、微波时间60 s，分别采用300、500、700、900 w的微波功率提取多酚，测定多酚含量.

2.3.2微波时间对资木瓜多酚得率的影响

称取1.0 g脱脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、乙醇浓度60%、微波功率700 W，分别采用30、60、90、120 s的微波时间提取多酚，测定多酚含量.

肿瘤治疗包括手术、化疗、放疗等，治疗费用较高，且部分病人因疾病影响，身体素质减弱，不能承受原本工作压力，收入减少，进一步加重家庭经济负担。病人2:“这病又治不好，还花这么多钱，啥时候是个头。”病人6：“以前家里老人、孩子都靠我挣钱养家，现在有了这个病，也不能出去打工了，只能在老家找点轻松的活。”此外，医疗费用支付方式对病人服药依从性有重要影响，其中公费病人服药依从性高于有医疗保险病人，有医疗保险病人服药依从性高于自费病人[14]。病人5：“这个升白细胞药多少钱,贵不？给报销不？尽量给我开一些可以报销的药。”病人8：“我是自费，看病都是自己掏钱，细胞偏低一点没事，我多吃点(白细胞)就上来了”。

2.3.3乙醇浓度对资木瓜多酚得率的影响

称取1.0 g脱脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、微波功率500 W、微波时间60 s，分别采用40%、50%、60%、70%的乙醇浓度提取多酚，测定多酚含量.

2.3.4料液比对皱皮木瓜多酚得率的影响

称取1.0 g脱脂木瓜干粉，按照微波功率500 W、微波时间60 s、乙醇浓度50%，分别采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比提取多酚，测定多酚含量.

2.4　正交试验设计

在单因素实验结果的基础上，每个因素取3个水平，按照L9 ( 34)设计正交试验，通过标准曲线方法测定多酚含量，并进行方差分析，确定最优提取方案.

2.5　数据处理及统计分析

利用IBM SPSS Statistics软件进行正交设计和分析，利用OriginPro 8进行统计分析和绘图.

3　结果与分析

3.1　标准曲线的绘制

标准曲线方程为：y=103.11x-0.2679，R2=0.9987，式中x为没食子酸质量浓度 ( mg /mL ) ，y为吸光度值. 各浓度及其对应的OD值见表1.

表1　标准曲线测量结果Tab. 1　Standard curve measurement results

3.2　单因素实验结果与分析

3.2.1微波功率对资木瓜多酚得率的影响

由图1可知，微波功率对多酚提取效果影响较大，吸光度随着微波功率的变化而变化，当微波功率在300～700 W时，随着多酚浓度提高吸光度呈现上升趋势，在700 W时达到最大值0.8555. 微波功率在700～900 W时，多酚浓度降低. 其原因可能是当微波功率大于700 W时，微波产生的热量过多，破坏了部分多酚的结构，吸光度下降[15](以下吸光度值均为稀释两倍后测得).

图1　微波功率对多酚得率的影响Fig.1　Effect of microwave power on the yield of polyphenols

3.2.2微波时间对资木瓜多酚得率的影响

微波时间在30～60 s时，随着微波作用时间的延长，多酚不断溶解，吸光度呈明显上升趋势，在60 s时达到最大值0.917(图2). 当微波时间大于60 s时，多酚浓度下降，吸光度几乎呈直线下降趋势，原因可能是微波作用时间过长致使热量过高，从而破坏了多酚的结构，导致多酚含量下降.

图2　微波时间对多酚得率的影响Fig.2　Effect of microwave time on the yield of polyphenols

3.2.3乙醇浓度对资木瓜多酚得率的影响

由图3可以看出，随着乙醇浓度的增加，吸光度先增大后逐渐减小，在乙醇体积分数为50%时，吸光度值达到最大值0.989.多酚类物质在植物中常以氢键和疏水链的形式与蛋白质、多糖结合形成稳定的复合物.当乙醇的体积分数过低时，不足以与多酚类物质形成氢键同原有氢键竞争，导致最终提取的多酚含量不高[16]；乙醇的体积分数过高时，溶剂极性降低，导致多酚得率下降，脂溶性物质溶出增多[17].

图3　乙醇浓度对多酚得率的影响Fig.3　Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

3.2.4料液比对资木瓜多酚得率的影响

料液比为1∶25时，吸光度值最大为0.743(图4). 料液比在1∶25的基础上，增加或减少，多酚浓度均呈现下降趋势，吸光度值减小，原因可能是增加溶剂有利于多酚的溶出[18]，但是当料液比高于1∶25后，由于溶剂过多，同样的微波条件下的热量不足以促使更多多酚溶出,因而多酚含量下降.

图4　料液比对多酚得率的影响Fig.4　Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols

3.3　正交试验

根据单因素实验结果，确定微波提取资木瓜多酚的最佳工艺条件分别为：微波功率700 W，微波时间60 s，乙醇浓度50%，料液比1∶25.以上条件作为参考，对微波功率、微波时间、乙醇浓度、料液比进行4因素3水平正交试验设计. 因素与水平见表2，正交方案及结果分析见表3.

表2　正交试验因素及水平设计Tab.2　Orthogonal L9(34)factors and levels

由表3可见微波法提取资木瓜多酚正交试验各处理条件下的多酚含量，对该结果进行极差分析可知，在微波提取过程中，各因素对多酚得率的影响次序为：C(乙醇浓度)>A(微波功率)>D(料液比)>B(微波时间),为实现多酚得率最大化，应采用A1B3C1D2组合条件进行资木瓜多酚的微波提取，也即微波功率500 W,微波时间90 s，乙醇浓度40%，料液比1∶25.

表3　正交方案及结果Tab.3　Design and results of L9(34)Orthogonal test

3.4　验证实验

根据正交试验的优化结果进行验证实验，称取4份1.0 g脱脂木瓜干粉，每份按照上述最优提取条件进行3组平行试验，所提取的多酚含量分别为44.99 mg/g、45.11 mg/g、45.42 mg/g、45.81 mg/g，平均含量为45.34 mg/g，与正交试验第6组条件(A2B3C1D2)的提取结果相近，且两组提取条件的差别也仅限于微波功率，因此正交试验结果所得到的提取条件是可靠的，为实现提取效率最大化，将最优提取条件定为A2B3C1D2，也即微波功率700 W,微波时间90 s，乙醇浓度40%，料液比1∶25.

4　结语

以资木瓜为原料采用微波辅助提取木瓜多酚，通过单因素试验以及正交设计优化出最佳提取方案：微波功率700 W,微波时间90 s，乙醇浓度40%，料液比1∶25，利用该工艺提取所得的资木瓜多酚含量为：47.27 mg/g，得率为4.73%. 该方法较常规浸提法具有提取时间短、提取效率高的优点，为提高资木瓜的经济效益奠定了初步的技术基础.

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