微囊藻毒素-LR的定量荧光纳米微球免疫层析检测

张艺 丁新良 张珏 周彬 郭明明 黄飚

（江苏省原子医学研究所 卫生部核医学重点实验室 江苏省分子核医学重点实验室，无锡 214063；无锡市疾病预防控制中心，无锡 214023）

微囊藻毒素（MC）是一种环状七肽物质，是古生物蓝藻的代谢释放产物，有多种异构体，对动物和人有强烈的肝毒性［1-2］。其中最常见、水体含量高、毒性最大的是MC-LR，能诱发肝癌，低剂量的MC-LR还能损伤神经细胞、生殖细胞，甚至危害肾、肺等器官［2-8］。在淡水水体富营养化的今天，蓝藻爆发事件时有发生，代谢产物MC-LR对人类的健康构成了严重威胁，而此毒素在水体中自然降解缓慢，使用现行自来水处理工艺难以去除［9-14］。鉴于此，我国制定标准《GB5749-2006》要求对饮用水、湖泊水、河水和地表水的MC-LR含量进行定期监测。

因为检测手段的便利程度和准确程度，关系到各水厂和环保单位，关系到对蓝藻水华的控制、对水环境的综合治理，关系到居民饮用水安全和经济发展，意义重大。因此，建立符合我国实际情况，快速、准确、现场检测MC-LR的方法，必要而且迫切，具有良好的应用前景和推广价值。

目前常用的MC-LR检测方法包括：高效液相色谱法和酶联免疫法［15-18］，这些方法各自的特点如下：前者测得结果准确，但采用的仪器昂贵、操作繁琐、成本高；以后者为代表的免疫分析方法价格低、操作相对简单，但存在或仅能定性、准确度欠佳，或不能单样本检测等缺点，因此上述方法不能实现准确、快速、定量测定MC-LR。因此，本研究拟解决上述问题，运用试纸条层析的优势，建立可快捷、定量、简单检测该毒素的一种方法，并研制相应的试剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 水样源于无锡太湖水域，由无锡市疾控中心采样、收集。检测前，样品用0.45 μm膜过滤后，取澄清。

1.1.2 试剂与耗材 MC-LR标准品、MC-LR-牛血清白蛋白（MC-LR-BSA）、抗MC-LR多克隆抗体、MC-LF，均由无锡市疾病预防控制中心提供。羊抗鼠IgG由武汉华美提供。含有荧光染料异硫氰酸的高分子纳米微球，购自biodot公司。样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和卡壳，购自杰一公司。碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）由Sigma公司提供。MC-LR ELISA试剂盒，由江苏省苏微微生物研究有限公司提供。其他试剂均为沪试分析纯。1.1.3 仪器 免疫层析定量分析仪，上海互帼公司；ELX800酶标仪，美国BioTek公司；5417R离心机，美国Eppendorf 公司；超声仪，深圳洁康公司；喷金划膜仪和切条机，杭州赛凯生物公司。

1.2 方法

1.2.1 试纸条的制备

1.2.1.1 MC-LR抗体的预处理 将MC-LR单克隆抗体、MC-LR-BSA和羊抗鼠IgG，分别用0.05 mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液在4℃下透析过夜。

1.2.1.2 结合垫的制备 在高分子纳米微球溶液中加入碳二亚胺（EDC）（终浓度为20 mmol）和预处理过的MC-LR抗体，室温反应2 h，离心，去除上清液后，加入样品稀释液（含有1%BSA的0.05 mol/L，pH 7.2的磷酸盐缓冲液）至微球浓度为1.0 g/L，待用。用喷金划膜仪以3 μL/cm-5 μL/cm的量将制备好的微球喷涂于聚酯膜形成的结合垫上，避光的条件下于35-38℃烘干1 h，加入干燥剂封存备用。

1.2.1.3 硝酸纤维素膜的制备 使用含1%蔗糖的0.02 mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液，分别将透析过的MC-LR-BSA抗原和1 g/L的羊抗鼠IgG抗体，使用定量喷膜仪以1 μL/cm的量将两者以一定的间隔喷于硝酸纤维素膜上，35-38℃烘干1 h，加入干燥剂封存备用。

1.2.1.4 试纸条的组装 在底板中间先铺设硝酸纤维素膜，然后在与质控线相临近的一端铺吸水纸，使吸水纸与硝酸纤维素膜部分重叠；在与检测线相临近的一端铺结合垫，使硝酸纤维素膜与结合垫部分重叠；最后贴样品垫。试纸条结构如图1所示。用切条机切按0.4 cm宽度斩切后，装入塑料卡壳中。

图1 MC-LR-POCT试纸条结构

1.2.2 反应过程 使用前，先将试纸条和其他试剂室温放置15 min。将10 μL样品或者MC-LR标准品与50 μL样品缓冲液，滴加入试纸条的样品垫上，室温放置一定时间后，将试纸条卡壳放入检测仪器中读数，仪器可根据测定荧光值自动计算出样品的MC-LR浓度值。

1.2.3 统计学分析 每个样品均检测3次，对应数据用均值（X）或X±变异系数（X±SD）表示。用Origin 8.0软件绘制曲线。

2 结果

2.1 反应原理

MC-LR-荧光纳米免疫层析采用竞争型反应，经毛细管作用，样品中的MC-LR向结合垫方向移动，然后，带动了结合垫处耦联着MC-LR抗体的荧光微球向硝酸纤维素膜方向移动。当混合物到达检测线时，游离抗原、固定相人工抗原与荧光微球表面的抗体竞争结合，最终在检测线处形成抗原-抗体复合物。未被检测线捕获的微球，将与质控线上的羊抗鼠二抗，形成免疫复合物。其中，样品中MC-LR的含量与检测线上的荧光强度呈反比，荧光信号的强弱由数值显示，这使得样品浓度的定量成为可能。

2.2 检测线抗原浓度的选择

检测线抗原的浓度与抗体结合的效率决定了反应的信号强度，因此本研究率先探讨了检测线上MC-LR人工抗原的含量。使用1 μg/mL微球喷涂与结合垫，针对空白样品做检测，结果见图2。由图所示，0.5 g/L的MC-LR人工抗原适合喷涂在检测线上，此时可以在检测线获得较高的荧光信号。

图2 检测线上MC-LR-BSA含量与荧光信号强度的关系

2.3 微球标记量的选择

预处理过的MC-LR抗体和微球按照不同的质量比1∶200-1∶10，与EDC混合反应。获得的微球按照1 μg/L喷涂在结合垫上。用0和1 μg/L的MC-LR标准品作为样品，考察按照不同质量比标记的微球对反应结果的影响。测0 μg/L浓度样品时，有最高荧光值B0；1 μg/L与0 μg/L的比值B0/B1作为竞争反应效率的反映，比值越大，说明1 μg/L与空白浓度的区分度越大。结果见图3，可知抗体与微球反应比率为1∶50（wt∶wt）时，免疫反应竞争结合效率较高，空白样本的荧光值也相当较高，因此选为本研究的工作比率。

图3 微球标记量对结果的影响

2.4 结合垫微球浓度的选择

将微球用含有1%BSA，0.1%NaN3的0.05 mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释到0.12 μg/mL，0.25 μg/mL，0.5 μg/mL，1.0 μg/mL 等不同的浓度，并进行喷涂等处理，然后按前述方法反应检测。结果见表1，从上面的数据可以看到，喷涂不同的微球浓度，检测结果误差不同。当微球浓度较低时，标记抗体量不足，导致检测结果偏低，误差过大。当喷涂浓度为0.5 μg/L或以上时，误差降低，可控制在10%以内，从成本考虑，0.5 μg/mL的喷涂浓度合适。

表1 微球浓度对检测结果的影响（μg/mL）

2.5 标准曲线的获得

根据优化的条件制备MC-LR免疫层析试纸条，即以0.5 g/L的MC-LR人工抗原喷涂检测线，抗体与微球反应比率为1∶50，使用该微球以0.5 μg/L的浓度喷涂于结合垫上。在试纸条的加样区加入不同浓度的MC-LR标准品（取6个不同的浓度，分别为0 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L，每个浓度做5个平行样）。膜层析反应 15 min后，仪器读取T、C线信号，以检测的样品荧光值信号为纵坐标，MC-LR标准品浓度为横坐标，建立方程并拟合得到标准曲线y= 730.42x2- 6158.4x+ 14665（R2= 0.985），见图4，然后通过该标准曲线得到标准卡，作为对样品中所含MC-LR浓度进行定量分析的基础。

图4 MC-LR荧光纳米免疫层析法的工作曲线

2.6 性能的评估

2.6.1 灵敏度 采用重复测定10孔空白标准品荧光值，以X-2SD计算，再带入标准曲线获得对应的浓度值，即为本研究测定MC-LR的灵敏度0.195 μg/L。2.6.2 准确性 本方法的准确性由添加回收率反映，即向空白水样中添加0.5、2 μg/L低、高浓度的标准物质，对应的MC-LR浓度分别为0.517±0.041和1.906±0.095 μg/L。回收率分别为103.4%和95.3%，平均回收率99.4%。方法回收率于90%-110%内，说明本研究的检测结果准确。

2.6.3 可靠性与精密度 取试纸和市售的MC-LR酶联免疫试剂盒（ELISA），分别测试同一样品，重复3次，验证试纸的检测结果准确性。表2结果说明：用该试纸和市售试剂盒检测的误差均小于10%，本方法的变异系数（SD/X）小于10%，该试剂的检测结果准确可靠。

2.6.4 特异性 MC-LF为MC-LR的异构体，三孔测定2 μg/L 的MC-LF对应的MC-LR含量，结果交叉反应率为1.75%，说明本方法采用的单克隆抗体特异性较好。

表2 不同浓度样本的MC-LR测定结果（μg/L）

2.6.5 稳定性 在加速稳定性试验中，将试剂于37℃放置6 d若稳定，则代表该试剂可在2-8℃保存6个月。将市售的MC-LR-ELISA试剂与37℃放置6 d的试剂比较，标准品系列的荧光强度下降幅度低于10%，说明试剂在2-8℃可以保存6个月，可满足实际使用的需要。

3 讨论

随着生物传感技术的发展，以及设备的小型化、便捷化，免疫层析技术得到进一步发展和快速推广应用。采用这一方法研发的试剂，一般情况下，加样15 min后，即可读取检测结果［19］。常见的免疫层析标记物为胶体金，对应的试纸条不需外部检测仪器，只需裸眼即可读取检测结果，可用于定性分析，区分阴阳性结果［18，20-21］。但这种标记物不能用于精确定量检测，也很难将弱阳性结果区分开来。因此，尤其对MC-LR这样需要定量分析的小分子物质，传统的免疫层析技术尚不能完全满足监测要求。

本实验所述定量检测MC-LR的纳米荧光免疫层析试剂将纳米荧光免疫技术、竞争法测抗原与具体试纸结构相结合，形成了一种可用于单次、定量检测MC-LR含量的试纸条，解决了现有纳米荧光荧光分析技术中MC-LR试剂不适合单样本、小批量检测的问题，也解决了现有的免疫层析技术仅能定性，不能准确定量的问题。本方法所述MC-LR高分子纳米微球，解决了荧光染料发光效率低从而造成检测不准确的问题，进而提高了检测灵敏度，达到0.195 μg/L，远低于1 μg/L的国家标准。方法的线性工作范围达到5 μg/L，特异性强，与市售商品化试剂盒一致性好，因此可以满足实际使用需求。

4 结论

本研究开发的定量检测MC-LR的纳米荧光免疫层析试纸，由荧光免疫层析试纸条和外壳组成，简单操作，性能稳定，对试剂长期存储有利；采用的仪器小，对工作环境要求低，便于推广使用。所述MC-LR检测试纸条灵敏度高，准确性好，操作快捷，具有实用性和良好的应用前景。

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