年龄效应对白杨硬枝扦插苗生长及其茎皮部解剖结构和叶片生化指标的影响

洪汉辉，康向阳，汪晓峰

(北京林业大学 生物科学与技术学院，林木育种国家工程实验室，北京 100083)

无性系林业起始于20世纪70年代，是世界范围内新兴的造林体系。无性系改良途径不仅方式简便、迅速、灵活，且它的遗传增益更为显著和直接，已经成为当前发展的趋势并已逐步进入定向选育、定向栽培、定向利用的时代[1-3]。但无性繁殖的成熟效应和位置效应会造成无性繁殖材料品种退化，严重影响品种遗传潜力的发挥[3]。成熟效应是指无性繁殖材料发育阶段对无性系苗效果的滞后影响，如扦插中采穗母树年龄越大，则发根期越长、生根率越低。成熟效应也被称为年龄效应[1,4]。具有年龄效应的无性繁殖材料其苗木幼年期的速生性会得到削弱，很快进入生殖生长，出现再生能力降低和生根困难的现象[3]。位置效应是指无性繁殖材料采集部位对无性繁殖效果的影响，如用母树冠部枝条扦插和嫁接繁殖，会出现斜向生长、开花结实提前、顶端优势不明显的现象[4]。在对青海云杉[5,6]、马占相思[7]、落叶松[8]的研究中发现，扦插或嫁接繁殖的苗木随繁殖材料年龄的增加，表现出早期生长迟缓、生根困难等位置效应和年龄效应。年龄效应一直是无性系造林的障碍，对林业生产造成重大的经济损失[9]。因此，开展无性繁殖材料因年龄效应累积导致品种退化的形成机理研究具有重要意义。

白杨扦插生根困难是世界公认的难题。朱之悌等[10]认为解决好优树间繁殖材料的幼年性和一致性问题是毛白杨无性系良种选育中的首要前提。通过对30年生毛白杨大树根萌条以及树冠上、中、下部位的当年生枝条的嫁接繁殖苗木对比试验研究，发现不同部位无性系间无论从物候、生长量、嫁接成活率、开花百分率等方面，都有明显的不同，表现出位置效应与年龄效应[11]。李新国等[1]对花枝嫁接和挖根促萌等方法繁殖的毛白杨优树的无性系进行了对比分析，证实了毛白杨无性系苗生长性状的年龄效应与优树年龄呈线性相关。郭长花[12]通过三倍体毛白杨树干基部、中部、冠部1年生枝条嫁接苗木的形态、生长以及生理生化等指标研究发现，嫁接苗的形态和生长指标存在显著差异，而生理生化指标大多无显著相关，只有IAA/ABA值随繁殖材料位置由低到高而表现为负相关。以上研究均涉及白杨无性繁殖材料位置效应导致的老化问题，而同一品种年龄效应导致的老化问题以及对无性系生产的影响则鲜见报道。

基于前人的研究成果，本试验以白杨杂种三倍体‘北林雄株2号’的不同年龄苗木插穗为材料，就扦插苗的生长状态、光合生理特征、根发育特征、茎插穗皮部解剖结构以及叶片生理生化等指标进行研究，探讨白杨插穗的年龄效应引发的老化规律及其对无性繁殖的影响，为科学制定白杨杂种三倍体良种繁育策略奠定理论基础。

1材料和方法

1.1　材料与处理

白杨杂种三倍体‘北林雄株2号’为人工诱导2n花粉授粉杂交选育出的银腺杨(Populusalba×P.glandulosa)×毛新杨(P.tomentosa×P.bolleana)的杂种三倍体新品种。本实验使用的无性繁殖材料采自山东省聊城市冠县国有苗圃。选取无病虫害、生长健壮的‘北林雄株2号’1、2、3年生母株的当年生硬枝条(3个母树年龄处理)，剪成10 cm长插穗，插穗直径为1.0 cm左右，扦插基质由沙土、营养土、珍珠岩按2∶1∶1混合而成。采用盆栽试验,按完全随机区组试验设计，每个年龄处理5个重复，每重复2盆，每盆扦插5株，共30盆，常规管理。扦插后待苗木生长至20 cm高后, 每个处理选取生长较为一致的苗木30株, 挖根统计生根指标，并采集15株苗木自顶端起第7～8片完全展开的成熟叶片2～3片，立即放入液氮冷冻后带回实验室，于-80 ℃冰箱保存，用于生理生化指标检测。扦插前及时取插条基部2 cm茎段的皮部材料，用4%多聚甲醛溶液固定，用于后续石蜡切片实验。1、2、3年生母株当年生枝条插穗的新生无性繁殖苗木，以下均分别简称为1、2、3年生。

1.2　测定指标及方法

1.2.1扦插苗木形态及生根指标使用卷尺对不同年龄段苗木的苗高、节间宽、叶柄长度以及插穗主根和侧根长进行测量，并对主根数、侧根数和生根率进行计数统计，用游标卡尺测量苗木地径，同时采用便携式叶面积仪对叶面积进行测量。根系效果指数=平均根长×生根数量/插穗总数。

1.2.2扦插苗木光合生理指标采用美国LI-COR公司的LI-6400XT型便携式光合作用测定系统，在晴朗无风的上午8:30～11:00测定扦插苗木光合生理指标。测定时需将仪器正确组装后预热30 min，待仪器稳定后每个处理选取生长较为一致的苗木30株,从顶端往下数第6～7片完全展开的健康成熟叶片，避开主脉，选择叶片中部位置进行测定，每株测定3～5片叶片，每个叶片重复3次。测定指标包括净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)。

1.2.3插穗皮部解剖结构扦插前及时取材，从插条基部切取2 cm茎段的皮部材料，用4%多聚甲醛溶液固定并抽真空至材料全部沉入固定液后4 ℃固定24 h；切片按照常规石蜡切片法制作，经脱水、透明、浸蜡、包埋，使用LEICA RM2245切片机切片，切片厚度为8 μm。后经过展片、烤片、脱蜡、复水、番红染色，使用中性树脂封片，显微镜进行观察并拍照。

1.2.4扦插苗木的生理生化指标参照李合生[13]方法测定成熟叶片可溶性总糖、可溶性总蛋白、脯氨酸、叶绿素、赤霉素、生长素和脱落酸等含量。

1.3　数据处理

采用Excel2007和SPSS19.0对所有数据进行处理和差异的显著性分析(Duncan法)。

2　结果与分析

2.1　年龄效应对白杨插穗皮部解剖特征的影响

白杨插穗皮部由周皮、韧皮部、形成层和木质部四部分构成(图1)。周皮位于皮部横切面的最外层，由木栓层、木栓形成层和栓内层构成，细胞呈扁平方形，细胞壁增厚，细胞染色呈鲜红色；韧皮部位于形成层与周皮之间，占整个皮部解剖结构的1/2以上，由筛管和韧皮薄壁细胞组成，筛管随机分散在韧皮部内，细胞染色呈浅红色；形成层位于木质部和韧皮部间；木质部位于最内一层，由排列整齐的木薄壁组织细胞组成，细胞染色呈鲜红色，包括轴向薄壁组织细胞和径向薄壁组织细胞，径向薄壁细胞组成木射线，导管随机分散在木质部内。图1显示，白杨插穗皮部周皮表现为2、3年生显著厚于1年生，3年生又略厚于2年生；插穗皮部木质部也表现为2、3年生比1年生发达，并显著厚于1年生，3年生木质部厚度略大于2年生。据此认为，白杨2、3年生插穗皮部周皮对生根的机械阻力显著大于1年生，阻碍根的发生，且2、3生插穗皮部组织发育较1年生插穗更加完善，分化程度更高，再分化生根能力相对较弱。

A.1年生插穗；B.2年生插穗；C.3年生插穗；Xy.木质部；Cb.形成层；Ph.韧皮部；Pd.周皮图1　白杨不同年龄插穗皮部解剖结构的变化A. Annual cuttings; B. Biennial cuttings; C. Triennial cuttings; Xy. Xylem; Cb. Cambia; Ph. Phloem; Pd. PeridermFig.1　Anatomical structure changes of bark among different ages of cuttings in white poplar

2.2　年龄效应对白杨插穗生根和新生苗生长的影响

2.2.1新生苗生长指标随插穗年龄的增大，新生苗苗高、叶面积、叶柄长度、节间宽度和地径等呈逐渐降低趋势，即1年生>2年生>3年生(表1)。其中，2年生和3年生苗高分别比1年生材料降低了11.27%(P>0.05)和40.00%左右(P<0.05)，它们的叶面积分别比1年生材料显著降低了20.79%和22.79%。新生苗叶柄长度、节间宽和地径在各年龄插穗间差异更明显，年龄较大插穗均显著低于年轻材料(P<0.05)，如2、3年生插穗新生苗叶柄长度分别比1年生显著降低了14.52%和27.40%，其节间宽分别显著降低了32.26%和45.16%，同期地径则分别显著降低了19.70%和31.82%。以上结果说明，白杨1年生插穗新生苗生长量、生长状态及速生性明显优于2、3年生苗，2年生苗又优于3年生苗。年龄效应对白杨插穗新生苗有很大的生长滞后作用，年龄越大的扦插材料其年龄效应越明显，新生苗的生长状态也越差。

2.2.2插穗生根指标表2显示，随着白杨插穗年龄的增大，其主根数、主根长和根系效果指数都呈现了逐渐降低的趋势，其中2年生均比1年生显著降低，但2、3年生材料之间差异不显著；其中，与1年生插穗相比，2、3年生的主根数分别降低了15.35%和19.30%，主根长分别缩短了51.91%和54.18%，同期的根系效果指数分别降低了62.81%和63.67%，为降幅最大的生根指标。同时，插穗侧根长和侧根数随着插穗年龄的增大则无明显的规律性变化。另外， 2、3年生插穗生根率均比1年生显著降低了20.69%(P<0.05)，但 2、3年生之间并没有表现出年龄效应。据此认为，白杨年龄越大的插穗生根能力也越弱，插穗的年龄对插穗生根率、主根数、主根长和根系效果指数有滞后作用，但对插穗的侧根数和侧根长则无显著影响。

2.3　年龄效应对白杨插穗新生苗叶片光合气体交换参数的影响

从表 3可知，随插穗年龄增大，白杨新生苗叶片净光合速率(Pn)表现出逐渐下降的趋势，2、3年生Pn分别比1年生显著降低了10.30%和47.27%，3年生Pn比2年生显著降低了41.22%；而胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)等指标变化的规律性不明显，基本上均以3年生苗较高，2年生苗最低。以上结果说明，白杨插穗年龄对新生苗的叶片净光合速率有显著的抑制作用，而与新生苗叶片的胞间CO2浓度、蒸腾速率和气孔导度(Gs)无直接关系。

表1　白杨不同年龄插穗新生苗生长性状指标的比较

注：同列不同字母表示苗木间在0.05水平存在显著性差异(P<0.05)；下同

Note: Different normal letters indicate significant difference among cuttings at 0.05 level (P<0.05)；The same as below

表2　白杨不同年龄插穗生根指标的比较

2.4　年龄效应对白杨插穗新生苗叶片生理生化指标的影响

图2显示，随着叶片发育进程，白杨各年龄插穗新生苗叶片可溶性总糖(TSS)、可溶性总蛋白(TSP)和脯氨酸(Pro)含量均基本呈逐渐增加的趋势，而其叶绿素(Chl)含量则均呈先增加后降低单峰曲线变化；随着插穗年龄的增加，新生苗叶片TSS、TSP和Chl含量均显示为逐渐降低趋势(1年生>2年生>3年生)，而Pro含量则表现为逐渐增加趋势(3年生>2年生>1年生)。

其中，1、2、3年生插穗新生苗叶片Chl含量均在T3(7月15日)时达到峰值，分别为2.385、2.178和2.118 mg/g；2、3年生苗Chl含量分别在T3和T5(8月15日)时期比1年生苗下降最明显，其相应降幅分别为8.68%和19.28%，这可能是导致其叶片净光合速率下降的重要原因(图2，A)。2、3年生插穗新生苗叶片TSS含量均在T1(6月15日)时与1年生苗差别最大，分别显著降低了22.39%和26.66%(图2，B)。新生苗TSP含量变化趋势与TSS含量类似，只是3年生苗的TSP含量在T4(7月30日)时达到峰值后开始出现缓慢下降的趋势；2、3年生插穗新生苗叶片TSP含量分别在T2(6月30日)和T5时期与1年生苗差异最大，相应降幅分别为37.74%和49.72%(图2，C)。3年生新生苗叶片Pro含量均在T5时期与1、2年生苗差异最大，分别比1、2年生苗显著增长了48.75%和31.53%(图2，D)。以上结果说明，白杨1年生插穗新生苗叶片的营养物质(TSS、TSP、Chl)的含量比2、3年生苗高，而与抗逆相关物质Pro含量则比2、3年生苗低。由此可见，年龄小插穗新生苗代谢能力明显高于年龄大的插穗苗木，生长迅速，且年龄胁迫要低于年龄大苗木。

表3　白杨不同年龄插穗叶的光合气体交换参数的比较

T1～T5分别代表6月15日、6月30日、7月15日、7月30日和8月15日；同期不同小写字母代表不同年龄插穗在0.05水平上差异显著(P<0.05)；下同图2　白杨不同年龄插穗新生苗叶片生理生化指标含量的动态变化T1- T5 stand for June 15th, June 30th; July 15th, July 30th and August 15th respectively; Different lower letters within same time indicate significant differences among cuttings of different ages at 0.05 level (P<0.05). The same as belowFig.2　The dynamic changes of physiological and biochemical indexes in leaves of white poplar cuttings with different ages

图3　白杨不同年龄插穗新生苗叶片赤霉素含量、生长素含量、脱落酸含量和IAA/ABA值的动态变化Fig.3　The dynamic changes of gibberellin, auxin,abscisic acid contents and IAA/ABA in leaves of white poplar cuttings with different ages

2.5　年龄效应对白杨插穗新生苗叶片激素水平及比例的影响

在叶片发育过程中，各年龄插穗新生苗叶片赤霉素(GA)、生长素(IAA)含量和IAA/ABA均始终表现为1年生>2年生>3年生，而其叶片脱落酸(ABA)含量表现正好相反；随着叶片发育的进行，各年龄插穗新生苗叶片GA含量均为先升高后降低，其IAA含量和IAA/ABA均表现为逐渐下降的趋势，而其ABA含量均表现出不同程度上升趋势(图3)。

其中，叶片GA含量在1年生再生苗中于T4时期达到峰值(390.85 ng/g)，而在2、3年生再生苗则均于T3时期达到最大值(326.34和310.32 ng/g)，且2、3年生苗多与1年生苗差异显著(P<0.05)；与1年生苗相比，2和3年生苗GA含量分别在T4和T5时期降低最多，降幅分别为22.97%和25.22%(图3，A)。同时，1、2年生插穗再生苗叶片的IAA含量随着时间下降速率较3年生苗快；3和2年生插穗苗叶片的IAA含量始终显著低于同期1年生苗，且分别在T1和T2时期与1年生苗差异最大，分别比1年生苗相应显著降低了57.16%和36.25%(图3，B)。此外，随着叶片的发育，3个年龄材料再生苗的ABA含量以3年生增长速度最快，而1、2年生苗增长平缓，增幅相当，且除了T2时期外，三者间在其余时间均具有显著差异；与1年生苗相比，2年生和3年生苗ABA含量分别在T1和T5时期差异最大，分别是1年生苗的2倍和2.8倍左右(图3，C)。另外，IAA/ABA与生长素IAA含量的变化趋势相同，但与ABA含量的变化趋势相反;各年龄再生苗IAA/ABA的差异在T1、T2、T4、T5时期均达到显著性水平(P<0.05),而在T3时期仅1年生苗与2、3年生苗差异显著，但2、3年生苗之间差异不显著(图3，D)。以上结果说明，白杨年龄大的插穗新生苗内部与生长相关的激素(IAA、GA)含量较年轻插穗新生苗少，而与衰老相关的脱落酸(ABA)含量则明显增加。据此认为，随插穗年龄的增加，插穗新生苗叶片的IAA、GA及IAA/ABA逐渐降低，而ABA含量则逐渐升高，提示这些激素的水平可以作为白杨插穗衰老程度的标志。

3　讨　论

迄今，白杨扦插繁殖仍然存在着诸多问题，其中插穗材料老化和插穗生根率低等问题尤为突出。传统的无性系改良方法已经很难对插条老化内在的生化和分子机制做出解释，因此新一轮毛白杨改良策略的思考和实践显得尤为紧迫[3,14]。目前，白杨插条老化在生产实践中的研究主要集中于生根率与成活率这两个方面，缺乏系统全面深入的探讨。本试验从白杨杂种三倍体‘北林雄株2号’插穗新生苗的生长状态、光合生理特征、插穗生根特征、茎解剖结构以及叶片生理生化表现等方面系统剖析了年龄效应对其插穗新生苗的影响，为进一步探讨白杨无性系老化的分子机制奠定了基础。

母株年龄对插穗新生苗的生长状态、根发育特征、光合生理参数以及茎的解剖结构影响较大。植物组织的老化是植物生长发育的必然过程，植物年龄越大，组织越老化[11]。从母株身上继承的年龄，在不同的物种间可能表现得不同，但总体趋势是插穗年龄越大，其新生苗木的生长状态越差。前人在对火炬松、落叶松、桉树、扭叶松、青海云杉等木本植物的研究中发现：随插穗年龄增加，无性系苗的苗高、地径、叶面积、叶柄长度、光合速率，生根率呈递减趋势[15-20]；插穗生根的难易程度和插穗的结构有一定关系，如从红豆杉插穗的解剖结构发现周皮中存在1圈环状的厚壁细胞会延长生根时间[21]；此外，柯益富等将鸡桑插穗解剖后发现插穗茎木质纤维、韧皮纤维和木栓层等较薄，对生根的机械阻力变小，能促进生根[22]，本研究与前人研究结果一致。本研究在比较了不同年龄’北林雄株2号’插穗无性系苗的生长状态、根发育特征、光合生理参数以及茎解剖结构后发现：随插条年龄的增加，其地径、叶面积、叶柄长度、苗高、生根率、主根数、主根长、根系效果指数及光合速率均呈现下降趋势；年龄大的插穗其茎皮部周皮变厚，木栓层细胞壁木质化加重，加大了插穗生根的机械阻力，阻碍根的发生；且年龄大的插穗木质部发达，分化程度较年龄小的插穗高，因此再分化生根的能力降低，这可能是导致年龄大插穗生根率降低的重要原因。综合上述分析得出，插穗的年龄是导致插穗新生苗老化和插穗生根率低的重要因素。

可溶性总糖、可溶性总蛋白、叶绿素、脯氨酸及激素等含量的多寡能反映出植株代谢能力的强弱和新生苗的生长状态。近些年，对悬铃木、巨尾桉不同年龄硬枝扦插时发现，随着年龄的增加，可溶性总糖、可溶性蛋白及叶绿素等含量出现逐渐下降的趋势，而脯氨酸的含量呈上升的趋势[23-26]；在对红皮云杉不同年龄插穗的研究中发现，内源植物激素含量与其生根率之间有密切的关系, 插穗的GA4、IAA含量随着母株年龄增加而降低，ABA含量则表现相反，也有证据证实内源赤霉素含量随树木年龄的增加逐渐降低，如施加外源赤霉素处理时则具有复壮效果[27-28]；类似的现象在青海云杉的研究中也被发现，即着插穗年龄的增加，其内源激素IAA、GA和KT减少，而ABA含量上升，IAA/ABA也随年龄的增加而降低[6]。本研究与前人研究结果一致，‘北林雄株2号’再生苗叶片可溶性总糖、总蛋白、叶绿素、GA、IAA等含量均随插穗年龄的增加逐渐降低，而脯氨酸和脱落酸则表现出随年龄增加而增大的现象。据此可以认为，插穗的年龄是导致新生苗叶片相关生化物质代谢减弱的重要因素。

综上所述，优树白杨杂种三倍体‘北林雄株2号’的扦插无性繁殖苗极易受母株年龄的影响。与1年生相比，2、3年生材料显示出发育迟缓的整体性衰老状态，严重制约其无性系苗遗传潜力的发挥。因此建议，在进行白杨扦插育苗繁殖时，应选择年龄较小母株作为无性繁殖材料的来源，可最大限度降低年龄效应对无性系苗的影响，从而提高无性系育苗的成功率。

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