Glu在适量饮用贵州某食用白酒1型糖尿病小鼠表达的变化

李容瑢，梁文妹，夏白娟，李一欣，王燕林，尹　丹

（贵州医科大学组织学与胚胎学教研室，贵州贵阳 550025）

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)发病率近年来呈升高趋势，主要患病群体为儿童及青少年。胰岛α及β细胞的稳态被打破是T1DM发病的直接因素。胰岛α细胞主要分泌胰高血糖素（Glucagon,Glu），Glu促进肝糖原分解及糖异生等作用而升高血糖[1]，同时可调控β细胞分泌胰岛素（Insulin,Ins）的功能[2]。研究发现，敲除实验动物Glu受体基因后破坏其胰岛β细胞，并不会引发高血糖，且可以修复β细胞部分功能[3-4]，故Glu在T1DM发病过程中也具有重要作用。

中国白酒成分除酒精与水外还含有丰富的生物活性物质，适量饮酒与健康的关系也受到越来越多的关注。有关饮酒对胰岛Glu的分泌影响的报道并不多见，有研究认为，适量饮酒能够降低正常人血浆Glu水平[5]，Aagaard[6]则发现健康不定期饮酒者，饮酒后Glu分泌有所增加。本实验通过建立小鼠单纯饮酒、T1DM饮酒模型，观察小鼠胰岛Glu表达变化并检测胰腺Glu mRNA表达水平，探讨适量饮酒在T1DM小鼠发病过程中对α细胞可能的作用。

1　材料与方法

1.1　实验动物与试剂

6～8周正常雄性C57BL/6J小鼠210只，由贵州医科大学动物实验中心提供；链脲佐菌素（streptozotocin ，STZ），Sigma公司；54%vol董酒；小鼠抗Glu多克隆抗体，新西兰Watpa公司；免疫组织化学SABC试剂盒，武汉博士德公司；DAB显色剂，北京中杉金桥生物技术有限公司；GCG、β-actin引物由上海生工生物有限公司合成；RNA逆转录试剂盒，Thermo公司。

1.2　动物分组

C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后，随机分为单纯饮酒低剂量组(liquor consumption-low dose group,L-LDG,2.5 mL/kg·d,n≥6)、单纯饮酒高剂量组(liquor consumption-high dose group,L-HDG,5.0 mL/kg·d,n≥6)；糖尿病组(diabetes group,DG,n≥6)；糖尿病-饮酒低剂量组(diabetes-low dose group,D-LDG,2.5 mL/kg·d,n≥6)，糖尿病-饮酒高剂量组(diabetes-high dose group,D-HDG,5.0 mL/kg·d,n≥6)、空白对照组(blank control group,BCG,n=3)。

1.3　模型制作及标本处理

单纯饮酒组及糖尿病饮酒组均通过灌胃饮酒，每天1次，4:00 PM，连续灌胃至取材。灌胃第5周起糖尿病饮酒组及糖尿病组通过腹腔注射STZ 40 mg/kg，每天1次，连续5次，建立T1DM小鼠模型[7]。空白对照组不做特殊处理。

各组小鼠均分别于开始注射STZ后3 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d取尾尖血测空腹血糖。每组分别取胰尾组织：（1）4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成4 μm连续切片，每例3张切片，切片间隔56 μm；（2）液氮速冻，用于real-time PCR。

1.4　免疫组织化学SABC法

切片常规化蜡入水，10%甲醇-H2O2，羊血清（1:10），滴加一抗Glu(1∶2000)，4 ℃孵育过夜，羊抗小鼠 IgG（1∶100），SABC 复合物（1∶100），DABH2O2显色，苏木精复染细胞核，中性树脂封片。0.01%PBS液代替一抗作阴性对照。

1.5　Real-time PCR检测胰组织Glu mRNA表达

引物序列：GCG上游引物5'TTTACTTTGTGGCTGGATTGC 3'，下游引物 5'CCTGTGAGTGGCGTTTGTCT 3'，扩增产物长度156 bp；β-actin 上游引物 5'TGCTATGTTGCTCTAGACTTCG3'，下游引物5'ATGCCACAGGATTCCATACC 3'，扩增产物长度174 bp。将各组胰组织匀浆按TRIzol法提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并将RNA按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA。Real-time PCR反应体系20 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各 0.4 μL，SYBR 溶液10 μL，超纯水7.2 μL；反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃7 s，55 ℃ 10 s，72℃15 s重复45个循环。以上反应在LightCycler480 Software Setup中进行。以β-actin作为内参，每个标本3个复孔进行结果分析。结果采用相对定量法，目的基因相对表达差异倍数采用2－△△CT法计算。

1.6　图像分析及形态学计量

随机取各时间点各组小鼠免疫组织化学切片3张，40倍物镜下，每张切片用BioMias图像分析系统计数5个胰岛。用Image pro plus 6.0图像分析系统检测α细胞的Glu平均光密度；测胰岛面积、有核α细胞数，按下列公式计算得α细胞面数密度(个/4000 μm2)：

其中：NA为面数密度，Nx为计数有核阳性细胞总数，Ar为计数胰岛总面积。

1.7　统计学处理

应用SPSS l6.0软件包对所得数据用单因素方差分析进行统计分析，结果用x±s表示。

2　结果与分析

2.1　空腹血糖值

各时间点小鼠空腹血糖值如图1所示，BCG、L-LDG及L-HDG无明显变化（P＞0.05）；DG及DHDG空腹血糖值14 d开始升高，D-LDG 21 d开始升高且至28 d升至最高（P＜0.01），DG、D-LDG和D-HDG血糖均高于小鼠糖尿病成模标准11.1 mmol/L，与BCG、L-LDG、L-HDG相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；在21 d及28 d，DG、D-LDG及D-HDG相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2　胰岛α细胞形态和数量

BCG、L-LDG、L-HDG小鼠胰岛呈圆形或卵圆形，散在分布于胰腺外分泌部之间。DG、DLDG、D-HDG小鼠在注射STZ 7 d，即开始出现胰岛数目逐渐减少，面积有所减小。

α细胞主要分布于胰岛周边，数量较多，其免疫反应产物Glu呈棕黄色细颗粒状，分布于胞质内。随注射STZ时间延长DG、D-LDG、D-HDG α细胞数量有所增多，大部分α细胞表达Glu免疫反应强度无明显变化。

免疫组织化学显示胰岛α细胞见图2。图2中，A为空白对照组；B为饮酒低剂量组；C为饮酒高剂量组；D、E、F分别为糖尿病组7 d、14 d及28 d；G、H、I分别为糖尿病-饮酒低剂量组7 d、14 d及28 d；J、K、L分别为糖尿病-饮酒高剂量组7 d、14 d及28 d。

2.3　胰岛α细胞图像分析及形态学计量

各时间点小鼠胰岛α细胞Glu平均光密度值测定结果如图3所示，单纯饮酒及糖尿病各组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1　空腹血糖值检测结果(mmol/L)(x±s)

胰岛α细胞的面数密度值如图4所示，单纯饮酒各组小鼠NA与BCG差异无统计学意义；DG NA于7 d开始增加，D-LDL及D-HDL NA于10 d开始增加（P＜0.05）。

图2　免疫组织化学显示胰岛α细胞

2.4　Glu mRNA的表达

Real-time PCR结果检测Glu mRNA的表达在胰组织中的鉴定：Glu及β-actin mRNA的溶解曲线显示单一溶解峰，未检测到引物二聚体及其他非特异性荧光信号。

各组Glu mRNA相对表达量见图5：BCG、LLDG Ins mRNA表达在各个时间点无明显变化（P＞0.05）；L-HDG Ins mRNA在21 d及28 d有所升高（P＜0.05）；与BCG、L-LDG、L-HDG相比，DG、D-LDG、D-HDG Ins mRNA表达自10 d起逐渐升高（P＜0.05）。

图3　胰岛α细胞的平均光密度值(x±s)

图4　胰岛α细胞的面数密度值(x±s)

3　讨论

Glu是由胰岛α细胞分泌的29个氨基酸组成的多肽，对血糖有重要的调控作用。小鼠Gcg基因编码产物为Glu、GLP-1及GLP-2。T1DM发病过程中胰岛β细胞分泌的Ins绝对缺乏，同时Glu相对增多[8]，胰岛内稳态失衡，主要表现在空腹血糖及餐后血糖升高；但低血糖时Glu反而分泌相对不足[8-9]，使用小剂量Glu则可减缓T1DM发病过程中的低血糖症状[10]。

本课题组已在前期实验中观察了单纯饮用某白酒及T1DM小鼠饮酒后胰岛Ins的表达无明显变化[11]。本实验中单纯饮酒组小鼠空腹血糖值、胰岛Glu平均光密度值及NA，与BCG相比差异基本无显著性，显示该饮酒剂量及时间对小鼠无明显影响。L-LDG及L-HDG Glu mRNA自21 d起表达有所增加，但相对应时间点空腹血糖及Glu平均光密度、NA未见明显差异，可能与转录与翻译的时差性有关，有待进一步研究证实。

图5　胰组织中Glu mRNA的转录水平(x±s)

DG、D-HDG空腹血糖值自14 d时明显升高，胰岛Glu NA增多、Glu mRNA表达增加，考虑T1DM发病过程中随胰岛β细胞逐渐被破坏，α细胞数量增多填充胰岛，胰岛稳态被打破。而D-LDG空腹血糖值升高较DG及D-HDG时间晚，可能与以下机制有关：适量饮酒抑制肝脏糖异生而降低空腹血糖水平[12]，增加脂联素及高密度脂蛋白分泌等方式提高组织对Ins的敏感性[13-14]。

饮酒量的差异对糖尿病进程有不同程度的影响[15]，急性过量饮酒可导致Ins分泌减少而血糖升高[16]，Shai[12]的研究则表明适量饮酒能够降低糖尿病患者的空腹血糖值。同时饮酒的种类的差别也对糖尿病有不同程度影响[16]。中国白酒酿造所采用的固态多微酿造工艺，使其与其他种类的酒相比具有更独特的风味和多样生物活性成分，如萜烯类化合物、脂肽类化合物、吡嗪类化合物、亚麻酸等[17-18]，在本实验中这些生物活性成分也可能对T1DM的进程有一定影响。

综上所述，在本实验设定的剂量及时间内，单纯饮用该白酒小鼠Glu表达改变不明显；适量饮酒对糖尿病小鼠Glu表达亦未见明显影响。

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