凝集素的血凝监测方法研究

重庆邮电大学生物医学工程研究中心　夏　爽　陈仟仟　程　星　陆　伟　李章勇

0　引言

凝集素[1]是指一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。植物凝集素[2]对血红细胞的凝集作用是很重要的一个功能，因此我们在这方面的研究显得十分必要。

现凝集素的血液凝集实验所采取的手段通常是用倍比稀释法，此方法具有以下缺点：观察者通过肉眼观察，来判断是否发生凝集反应以及反应效果的强弱。此方法判断的结果往往因人而异、主观性强、误差率高。且肉眼无法记录反应过程。因此迫切需要一种可以克服上述问题的方法，图像处理技术为其提供了新方向。

目前，范一峰[3]等将OTSU算法和数学形体方法结合起来能够有效的提取昆虫的图像；刁智华[4]等利用2G-R-B提取类病斑后进行二值化，再通过面积阈值分割法实现了棉花病叶害螨的图像分割；员伟康等以新疆植物药的花和叶作为研究对象，运用最大类间发筛选得到图像分类的特征。殷晓丽[5]等人在凝集素的试验中，采用的是“V”型板倍比稀释或显微镜观察法。但上述研究对凝集素的效价判断主要还是利用肉眼观察的方式，而图像处理技术应用的场景也未曾涉及到凝集素对血液的试验中来。本文以凝集素和血液的实验样品为研究对象，采用自动阈值选取的方法对实验样品中凝集和沉降区域进行二值化分割，并选取特征值分析变化情况来定量判断和监测实验过程及结果，为今后科研工作者在凝集素的性质研究和观察对比提供一种新的动态监测方法。

1　监测方法设计

1.1　滤波处理

采集的图像受光照强度变化、实验室工作人员走动等原因，都可能造成噪声干扰。为了去除多余噪声，采用中值滤波对每张图像进行处理。中值滤波[6]是将每一个像素点的灰度值设为该点某邻域中的所有像素点灰度值的中值，以此达到让周围像素值接近真实值，并且消除鼓励噪声点的效果。这种方法能够较好的保持图像的边缘和纹理信息，结果如图1所示。

1.2　图像分割

观察图1中的灰度图像，此处图像的背景色调单一，针对这样的图像特点，采用阈值分割[7-10]算法来对图像进行分割。由于实验的血液样本和凝集素浓度有变化，光照受外界条件影响等原因，图像的灰度值存在差异，因此无法通过一个固定的阈值来进行分割，需采用一种能自动确定阈值的方法。

图1　实验结果灰度图

1979年日本学者大津提出的基于类间方差最大化的分割算法，简称OTSU[11]。该算法简单稳定，一直被认为是分割阈值自动选取的最优方法。首先根据需要处理的图像特点，选取一个初始的阈值，把图像分为两个区域A和B,及分别为前景和背景；然后对两个区域中的像素点进行数学运算，计算出两个像素群的方差；这时让初始阈值根据一定的法则进行有规律的变化，就能得到一系列的不同方差值；直到得到的类间方差与类内方差的比值最大的时候，就认为此刻所选用阈值最能使图像分割得明显，即得到最优阈值[12]。类间方差的公式为：

其中A为目标区域，B为背景区域，是A区的平均灰度，是B区的平均灰度，而U为整幅图像的平均灰度。和分别是A区域和B区域占整幅图像的比例。分割结果如图3所示。

图2　阈值分割图像

1.3　面积比值分析

图2与原始图像的对比不难发现，图像二值化分割出的中心黑色区域与血液沉降到V型板底部所形成的区域的大小吻合度较高，说明OTSU算法的分割有效并具有很高准确性。而在实验反应过程中，血细胞的悬浮状态一直在改变，也就是V型孔中血液呈现出的红色区域大小在随时间改变。凝集的沉降和凝集的状态与凝集素的作用大小密切相关，因此有必要对沉降区域的面积变化进行分析。基于此，以时间为横坐标、二值化图像中黑色部分面积占图像总面积的百分比为纵坐标，计算数据，统计并进行分析。

1.4　度差分析

上述试验中，实验开始的一段时间后，血沉降的比例大小开始以一定的速率下降，并在一定时间内完成反应，达到稳定状态。然而在开始下降之前的一段时间，百分数的的图像波动很大，其原因是刚开始实验时，样品与PHA混合均匀，整体呈现均匀的红色状态，而反应发生后要出现明显效果需要一定的时间，这时候进行图像的分割，阈值的自动选取容易出现误差。在凝集素浓度较低时，凝集效果不明显，容易造成对照实验与实验组的差异化不够明显。采用若单单只做一次实验可能会被当成误差忽视掉，因此需要新的算法来使得其差异化更加明显。针对这一现象，设计了灰度差分析算法来表示实验样品直接的差异：计算灰度图像中最大灰度值与最小灰度值得差值，以时间为横坐标作图分析。

2　监测系统设计

2.1　材料制备

（1）BS溶液配置：调pH至7.2。

（2）菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris agglutinin，以下简称PHA）：配成不同浓度的PHA凝集素溶液（1000、500、250、100、50、25ug/ml）。

（3）血液悬浮液配置：将全血与PBS溶液配置成体积分数为10、8、5%备用。

2.2　血凝集监测实验设计

根据每次的实验设计要求，依梯度选取适当浓度的PHA溶液和三种不同体积分数的全血悬浮液，在96孔V型微量反应板上进行实验。每组实验组设置一组对照组，每孔50ul（25ul血液样品+25 ul凝集素/25ulPBS）。在血凝板正上方架设摄像头（高度一定，约为10cm），从所有试剂混合均匀开始拍摄，到血液与凝集素反应结束停止拍摄，时间约为1小时（凝集反应时间），每100s取一副图像，流程如图3所示。

图3　动态监测流算法流程图

3　实验验证及结果分析

面积比值法—不同浓度凝集素作用分析：

选取五组浓度分别为1000、500、250、100、50ug/ml的PHA溶液，标识分别为F、E、D、C、B，同时设置一组不添加凝集素的作为阴性对照组，标识为A，在V型孔板上实验，分析结果如图4所示。

理论上：凝集素浓度越大，凝集的血细胞越多，则图像分割的二值化图像中值为0的区域占总面积的比例越大。图4中：首先，对曲线平稳的高度大小进行分析，高度由高到低正好是PHA浓度由高到低的顺序，完全吻合，说明该数据分析结果对照组，B1、B2都加入了浓度仅为25ug/ml，C1、C2都加入了浓度为250ug/ml的PHA得到的实验结果图。计算灰度图像中最大灰度值与最小灰度值得差值，以时间为横坐标作图分析，可得到图5。

图4　不同浓度凝集素检测曲线

图5　灰度差分析（横坐标单位是100秒；纵坐标是灰度差大小）

此组实验与图4实验设置相同，仅多增加了一组浓度为250ug/ml的PHA，重复实验之间得到的结果的吻合度较高。同理，凝集效果越好，视频图像的变化越小，因此灰度差的变化越小；反之，差值变化越大，但最终差值都会趋于稳定。图5中的曲线与这一理论推测完全吻合。图5中A、B、C三组实验结果有明显差异，特别是相比较与图6中A与B之间的微小差距，图5中A和C的曲线差距非常明显。这样的结果就可以排除图4方法中可能将正确的实验结果当成视为误差的可能性，更好的对实验结果做了区分，精确性更高。对比可知：此算法可对实验过程进行有效监测，并提高区分度和差异化，但反应时间的界定不如图4方法准确。

4　讨论与结论

本文研究对象主要是凝集素对血液作用的实验，针对科研工作者在常用的V型孔板上进行实验时采用肉眼直接观察的弊端，提出了一种基于图像处理技术的监测方法，对血凝过程进行监测，并对实验结果进行有效分析。将拍摄的实验视频作为基础，对其所得视频进行中值滤波处理、OTSU阈值分割二值化等步骤，计算并分析其中面积比值大小变化规律和灰度差变化规律，得到监测曲线。由本文实验结果可知，面积分析法可以很好且直观的反应出实验过程中血液沉降的现象，并对反应的时间、速度做出准确判断；并且可以根据最终稳定所得值的大小进行定量的分析和对比；灰度差值分析算法可以在低浓度的实验中，更有效的区分反应的效果差异。两种分析算法并不矛盾，并且相互起到了补充增强的作用，在实验中可以同时结合两种分析方法对实验过程进行监测和分析，可以丰富实验过程中的实验数据、观察到更为细致准确的实验现象，排除人主观因素的干扰。本文设计的基于面积分析法和灰度差变化监测的方法为今后凝集素对血液的实验观察监测提供了一种创新的新方向。

[1]Cui B X,Zhang K,Guo Y.Image segmentation algorithm combining minimum interclass variance with region growing[J].Journal of Shenyang University of Technology,2008.

[2]Weis W I,Taylor M E,Drickamer K.The C-type lectin superfamily in the immune system[J].Immunological Reviews,2010,163(1):19-34.

[3]范一峰,王义平.图像分割技术在昆虫识别中的应用[J].实验室研究与探索,2011,30(04):9-10+137.

[4]刁智华,王欢,宋寅卯,王云鹏.复杂背景下棉花病叶害螨图像分割方法[J].农业工程学报,2013,29(05):147-152.

[5]殷晓丽,李婷婷,刘东亮,王燕,孙素荣.豆科凝集素研究进展[J].中国生物工程杂志,2011,31(07):133-139.

[6]Gupta G.Algorithm for Image Processing Using Improved Median Filter and Comparison of Mean,Median and Improved Median Filter[J].International Journal of Soft Computing & Engineering,2011,1(5).

[7]Angelina,S.,Suresh,L.Padma,et al.Image segmentation based on genetic algorithm for region growth and regionmerging[C]//2012 International Conference on Computing,Electronics and Electrical Techn ologies,ICCEET,2012,E95-D(8):970-974.

[8]Tang,Xu-Dong,Pang,Yong-Jie,et al.Fast image segmentation method based on threshold[C]//Chinese Control and Decision Conference,2008:3281-3285.

[9]Qi C.Improved Two-Dimensional Otsu Image Segmentation Method and Fast Recursive Realization[J].Journal of Electronics &Information Technology,2010,32(5):1100-1104.

[10]Zhou C,Tian L,Zhao H,t al.A method of Two-Dimensional Otsu image threshold segmentation based on improved Firefly Algorithm[C]//IEEE International Conference on Cyber Technology in Automation,Control,and Intelligent Systems.IEEE,2015:1420-1424.

[11]Zhou C,Tian L,Zhao H,t al.A method of Two-Dimensional Otsu imaL.A Ceramic Crack Test Method Based on the Maximum Variance Ratio of Inter-Class and Intra-Class[J].Applied Mechanics & Materials,2014,633-634(5):372-376.

[12]Yuan X C,Lu-Shen W U,Chen H W.Rail image segmentation based on Otsu threshold method[J].Optics & Precision Engineering,2016.