间充质干细胞及其衍生物治疗糖尿病足溃疡研究进展

杨昌培 张 潜

(遵义医科大学基础医学院人体解剖学教研室，遵义 563003)

糖尿病足(diabetic foot, DF)是糖尿病的常见并发症，系由糖尿病引发的下肢神经和血管病变导致，进一步发展可加重为足部溃疡和(或)深层组织破坏，并可伴发创面感染，也即出现糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer, DFU)的严重情况。多发生于病程长，血糖控制差的糖尿病患者。目前糖尿病足还缺乏有效的治疗手段，预后差。研究发现，糖尿病足占到了所有因糖尿病有关问题住院比例的47%，且糖尿病足患者一生中发生足溃疡的比例可达15%以上[1]。DFU形成后很难完全愈合，14%～24%的DFU患者最终面临截肢的无奈选择[2]，有截肢适应症的DFU患者5年死亡率也高达39%～80%，接近恶性肿瘤的死亡率水平[3-4]。由于DFU缺乏有效的治愈手段，使得探寻新的治疗策略显得极为迫切，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)及其分泌的相关细胞因子在治疗DFU取得的良好疗效正好为其治疗带来了新希望。本文就MSCs及其衍生物治疗DFU的研究进展进行综述如下。

1 糖尿病足溃疡的形成

糖尿病足的发病机制目前尚未完全阐明，通常认为与糖尿病后周围血管病变、神经病变及一些致伤因素引发。糖尿病足周围血管病变主要见于股动脉、腘动脉、胫前动脉、胫后动脉以及膝关节以下的中、小血管，呈多部位多节段受累特征，病理基础为糖尿病后加速形成的广泛的动脉粥样硬化所致。动脉粥样硬化导致的周围血管病变，尤其是下肢动脉远端闭塞是糖尿病足的主要原因，也是糖尿病足截肢的主要原因。糖尿病足下肢动脉严重狭窄抑或闭塞将导致局部组织氧供和营养物质供应不足，任何轻微的皮肤破损都易导致皮肤溃疡的发生，DFU恶化导致深部组织感染或坏疽的最终截肢率高达85%[5]。糖尿病周围神经病变率可达61.5%[6]，与糖尿病足血管病变一起对糖尿病足的形成和加重及DFU病情起到推波助澜的不良作用。

2 糖尿病足溃疡难愈原因

O′Loughlin 等[7]认为DFU难以愈合的一个主要因素是创口的血管生成受阻。实验证实糖尿病创口难愈合是由于淋巴细胞中谷胱甘肽还原物质降低和过氧化氢酶活性升高使局部氧化应激增强；促凋亡基因Fas、Bax、Caspase-3的高表达及抑凋亡基因Bcl-2低表达导致细胞过度凋亡[8]，氧化应激的增加与细胞调亡进一步加重使伤口上皮化延迟，愈合困难。研究表明，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表达下调和白介素6(interleukin-6, IL-6)表达增多或两种因子活性改变导致组织修复能力下降，成为慢性溃疡创面长期不愈合的原因之一[9]。研究还发现，Wnt/β-catenin信号通路参与了糖尿病创面愈合过程，创面难以愈合与Wnt/β-catenin信号通路调节紊乱有关[10]。

3 间充质干细胞治疗糖尿病足溃疡的研究

MSCs由于具有组织来源广泛，取材方便，细胞增殖能力强，适宜条件下可向三胚层不同细胞分化的能力[11]，免疫原性低等特点而成为学界关注的研究热点。近年来的研究还发现，MSCs除了可分化为各种功能细胞发挥治疗作用外，其还具有炎症免疫调节能力[12]，成为MSCs治疗疾病的重要新机制，这对于治疗包括难治性创面的修复等疾病具有重要的理论意义。有研究采用人脐血CD34+干细胞局部注射到糖尿病大鼠后足创面，检测后显示创面成纤维细胞生长因子(FGF)表达增强，细胞凋亡减少，获得了良好的皮肤创面愈合效果[13]。通过大鼠股动脉注入人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)治疗大鼠DFU，结果表明，hUC-MSCs-特异性富集于目标溃疡组织，并通过刺激角质形成细胞释放细胞角蛋白19(CK19)和细胞外基质而促进溃疡组织再上皮化[14]。同样疗法用于治疗存在股神经变性及足溃疡的糖尿病大鼠，测到血清神经生长因子(NGF)浓度上调，腓肠肌毛细血管密度增加，股神经纤维排列松驰、轴突萎缩有明显改善，传导功能得到恢复[15]。来源于脂肪组织的间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells, AD-MSCs)联合肠促胰岛素类似物(exendin-4, Ex-4)对创面内皮细胞具有促血管生成的作用，并有助于加速糖尿病创面再上皮化和伤口闭合[16]。人AD-MSCs对糖尿病大鼠足背全层皮肤创伤修复有明显的影响，第15 d溃疡面积显著减少，有较多的肉芽组织形成，同时在伤口床中检测到较高水平的血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维生长因子(bFGF)表达。研究表明，人AD-MSCs移植具有促进糖尿病大鼠足创伤愈合的能力，提示其有望成为DFU的临床治疗新手段[17]，还有赖于进一步的临床研究予以确定。将骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)注射到糖尿病小鼠背部皮肤创口周边组织内，发现BM-MSCs可通过旁分泌胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1, IGF-1)降低创口胰岛素抵抗并促进溃疡愈合[18]。O′Loughlin 等[7]采用载有异基因BM-MSCs的胶原支架填充于糖尿病兔耳溃疡创面上，显示这一疗法能促进溃疡愈合及血管生成。 笔者采用VEGF基因修饰的BM-MSCs局部肌肉注射移植治疗，组织切片血管密度分析和数字减影血管造影(DSA)结果均显示移植大鼠的后肢血管密度明显提高，并能改善糖尿病大鼠后肢缺血[19-20]。葛胜洁等[21]采用糖尿病足患者自体外周血干细胞悬液，按3 cm×3 cm间距沿小腿病变动脉行走多点肌肉注射，6个月后增强CT检查见有新生侧支血管形成，且疼痛、麻木缓解，皮温升高，创面愈合比常规内科综合治疗的对照组更快，所有实验组50人中无一例患者发生截肢，移植后1月～7年内随访所有患者均未出现明显不良反应和并发症。

4 间充质干细胞分泌细胞因子促进糖尿病足溃疡愈合的研究

近年来的研究发现，MSCs还可通过分泌多种细胞因子促进创面愈合。通过对hUC-MSCs条件培养基的检测，发现其含高浓度的脑源性神经营养因子(BDNF)、VEGF、白介素8(IL-8)、表皮生长因子(EGF)、基质细胞衍生因子1(SDF-1)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等，这些因子能保护与逆转受损的神经元，促进血管生成及上皮化，吸引循环中的干细胞、祖细胞，迁移和渗透到靶组织并启动再生与修复[22]。采用脐血源内皮祖细胞移植到糖尿病小鼠创口后，创口组织人角质细胞生长因子(KGF)和血小板源生长因子(PDGF)表达升高，角质形成细胞和成纤维细胞增殖活跃，创面愈合明显提速[23]。García等[24]证实大鼠BM-MSCs在添有20%胎牛血清的DMEM培养基中培养可产生NGF和胶质源性神经营养因子(GDNF)；林育辉等[25]用ELISA检测BM-MSCs在体外无血清培养条件下具有分泌VEGF的功能，且在72h内 VEGF分泌达最高峰，上述研究表明，MSCs具有与生俱来的细胞因子分泌和调节作用能力，也是MSCs发挥旁分泌效应的生物学基础。Schinköthe等[26]利用细胞因子微阵列分析体外扩增的BM-MSCs的分泌谱，结果发现在120种细胞因子阵列中有44种显著增加，这些因子具有促血管生成、免疫抑制、抗凋亡、促细胞增殖的作用，进一步佐证了上述干细胞旁分泌作用的理论。近年来，越来越多的研究证实MSCs可通过分泌内含多种细胞因子等活性成分的外泌体发挥治疗作用[27]，将人胎盘组织来源的MSCs外泌体(PLAMSCs EXO)皮下注射进入小鼠耳廓后，增强了小鼠耳廓创面缺血性损伤模型的血管生成，提示PLAMSCs EXO在促血管生成活性中起重要作用。PLAMSC EXO可能是治疗缺血性疾病尤其是并有下肢血管狭窄或闭塞的DFU一种新的治疗方法[28]。这为今后提纯干细胞外泌体直接用于各种组织损伤性疾病的治疗提供了新的理论依据，并可避免采用干细胞移植的致瘤性风险等的担忧，且有比干细胞更好确定标准治疗剂量的优点。

研究证实，MSCs分泌的PDGF、bFGF、 VEGF、BDNF等细胞因子对 DFU具有治疗作用，但生长因子是小分子蛋白，溃疡局部微环境的理化性质易影响其生物活性，且DFU是慢性病程，需生长因子长时间恒定维持在有效浓度范围才能发挥最大作用。为维持生长因子在慢性溃疡局部达有效浓度，Losi等[29]用载有VEGF及bFGF的聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)制成的纳米颗粒，分别置于聚二甲硅氧烷及纤维蛋白支架上，填充于患有遗传性糖尿病小鼠的背部创口，观察到载有生长因子的2种支架在促创口肉芽组织形成、胶原沉积和再上皮化均优于不含生长因子的对照组。Choi 等[30]用结构稳定的表皮生长因子和bFGF，加载到具有生物相容性透明质酸胶原敷料基质中，再将其用于糖尿病小鼠溃疡治疗，结果显示材料中的生长因子可稳定释放，促进了创面组织再上皮化、新生血管形成和胶原沉积，明显改善创面愈合的速度与质量。将BDNF刺激预置有MSCs的电纺生物材料一并移植到后肢缺血小鼠的溃疡创面上，观察到创面组织中有较多新生血管形成；该研究结果表明，BDNF可通过诱导MSCs向内皮细胞分化，从而加速缺血性溃疡创面的愈合[31]。这些研究提示，恰当的干细胞投递方式(如联合不同的组织工程材料等)对干细胞发挥治疗效应及今后临床转化应用研究等均具有重要意义。

综上所述，DFU是临床常见的慢性难治性创面之一，主要系糖尿病足后下肢缺血进一步发展导致的严重并发症，目前还缺乏有效的治愈手段。近年来，随着以MSCs为主要候选干细胞用于包括糖尿病足及DFU的治疗研究不断取得的新进展，为治愈DFU带来了新的希望。现有的研究表明，MSCs可单独或结合分泌的各种活性细胞因子，通过移植后的体内分化和旁分泌效应尤其是后者发挥对DFU的治疗作用。近年来的研究发现MSCs可分泌富含各种细胞因子及调节性miRNA等生物活性成分的外泌体，使得采用外泌体治疗包括DFU在内的组织损伤性难治性疾病成为新的关注热点，这比以往直接采用干细胞用于移植治疗更为安全且疗效一致，为干细胞技术的临床应用提供了新的途径和思路。此外，采用不同的材料或结合细胞因子投递干细胞也是近年来的研究热点，这对今后采用MSCs及其衍生物治疗DFU的临床转化研究具有重要意义。