网状纤维染色技术改进

郑海燕，方庆全，索文昊

（厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003）

网状纤维存在于机体任何组织与器官，通过网状纤维染色观察病变组织中网状纤维的多少、粗细、疏密、有无断裂、有无塌陷等形态变化，对判断病变性质、程度、发展、转归具有重要意义[1]。但在实际工作中发现网状纤维染色有如下不足：用于网状纤维染色的氨银液配制皆较复杂；配制的氨银液有效期短，易造成浪费；染色背景常有银颗粒沉渣；染色过程中容易脱片；染色结果网状纤维和胶原纤维对比度欠佳。针对这些问题，我们改进网状纤维染色氨银液配制方法和网状纤维染色方法，可提高氨银液配制的成功率，延长氨银液有效期，提高网状纤维的染色质量，减少网状纤维染色的脱片率。

材料与方法

1 试剂

硝酸银，氢氧化钾，蒸馏水，浓氨水，高锰酸钾，草酸，硫酸铁铵，甲醛，氯化金，硫代硫酸钠，乙醇，滤纸。

2 氨银液配制方法的改进

由于传统网状纤维染色的氨银液配制较为复杂且有效期较短，在JCI“持续质量改进”理念指导下，厦门大学附属第一医院病理科对氨银液配制方法进行改进（表1）。

氨银液配制成功率：收集传统方法与改进方法配制的氨银液各30份，统计其配制成功率。传统配制法成功率为80.0%（24/30），改进配制法成功率为100.0%（30/30），改进配制法成功率显著高于传统配制法（χ2=4.29，0.01＜P ＜ 0.05）。

表1 两种氨银液配制流程比较Tab.1 Comparison on two preparation procedures of ammonia silver solution

氨银液有效期：同样置于4℃冰箱内保存，传统方法配制成功的24份氨银液有效期均数为2.85±0.28周，改进方法配制30份氨银液有效期均数为6.39±0.27周，改进方法配制氨银液的有效期显著长于传统配制法（t=9.01，P＜0.01）。

3 网状纤维染色方法的改进

由于传统网状纤维染色存在以下缺点：背景常有银颗粒沉渣、染色过程易脱片、网状纤维清晰度欠佳、网状纤维与胶原纤维对比度欠佳等，厦门大学附属第一医院病理科在改进氨银液配制方法的基础上，改进网状纤维染色方法如下：①减少高锰酸钾氧化、及其后续的蒸馏水洗、草酸水溶液漂白、蒸馏水洗的时间；②2%硫酸铁铵水溶液媒染后，不经自来水洗，直接蒸馏水洗；③氨银溶液作用前，裁剪略大于组织的滤纸铺于切片的组织上，再滴加改良氨银溶液覆盖滤纸表面，染10～15min。④氨银溶液作用后，不倾倒掉氨银液，直接用蒸馏水从一侧迅速冲洗掉氨银液。⑤10%甲醛溶液还原数秒即可。⑥0.2%氯化金溶液调色数秒至1min，以肉眼观由棕黄色变灰黑，再镜下控制（表2）。收集80例富含网状纤维组织的肝组织病例，每例连续切片2片，厚度为3.5μm，常规脱蜡后随机分为2组，1组用传统方法进行网状纤维染色（A组），另1组用改进方法进行染色（B组），比较2组的染色效果。

4 评价指标与评分标准

设定以下3项评价指标：背景清洁度、网状纤维清晰度、网状纤维与胶原纤维对比度。评分标准为：①背景清洁度（100分）：放大200倍镜下，切片背景见少量散在颗粒沉渣，不影响诊断，减1～10分；见少量散在及成团颗粒沉渣，不影响诊断，减11～20分；见多量散在颗粒沉渣，部分覆盖网状纤维，影响观察，减21～40分；见多量散在及成团颗粒沉渣，影响诊断，减41～100分。②网状纤维清晰度（100分）：网状纤维染色轻度淡染，结构尚可分辨，减1～10分；网状纤维与背景染色均轻--中度过深或过浅，网状纤维清晰度较差，减11～30分；网状纤维与背景染色均重度过深或过浅，影响观察，减31～100分。③网状纤维与胶原纤维对比度（网状纤维呈黑色，胶原纤维呈黄棕为优质的网状纤维染色，100分）：网状纤维染色轻度淡染，胶原纤维轻度深染，两者对比度尚可，减1～10分；网状纤维染色中度淡染，胶原纤维中度深染，两者对比度较差，减11～30分；网状纤维与胶原纤维均呈灰黑色或近似黄棕色，两者对比度差，减31～100分。由2名副主任以上医师对A、B 2组的染色片进行双盲评分，每项指标数据为评分的平均值。

5 统计学分析

采用SPSS 17.0 进行分析，计数资料率的比较采用χ2检验，计量资料用均数±标准差（¯x±s）表示，应用配对t检验两两比较，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

A、B两组染色结果比较见表3。由表3可见，A组背景清洁度、网状纤维清晰度、网状纤维与胶原纤维对比度3项指标的得分与B组。A组染色片（图1A）背景见多量沉渣、清洁度较差，网状纤维清晰度较差，网状纤维与胶原纤维对比度差；B组染色片（图1B）背景见未见明显沉渣、清洁度好，网状纤维清晰度好，网状纤维与胶原纤维对比度好。比较两组脱片率显示，B组脱片率（1.3%）明显低于A组脱片率（11.3%）（χ2=6.83，P＜0.01）。

表2 两种网状纤维染色方法流程比较Tab. 2 Comparison on two reticular fi ber staining methods

表3 两组染色结果比较Tab. 3 Comparison on staining results between two groups

讨 论

网状纤维染色在病理诊断中主要用于：①显示与鉴别肿瘤的性质、来源；②某些肿瘤的诊断[4]；③观察和研究癌组织的发生、发展及其恶性程度；④显示与观察组织中基底膜的变化；⑤识别坏死组织的结构及类型；⑥显示和研究肝组织病变。所以网状纤维染色是日常病理工作中不可或缺的一种染色方法，简化及稳定的染色技术在日益繁忙的病理科工作中显得尤为重要。

网状纤维染色中使用的氨银液是一种络合物，对组织有较强的亲和力，与组织中的蛋白质结合，再经甲醛还原成为银后沉积于网状纤维内及其表面，得以显色。配制氨银液时，所用的10%硝酸银水溶液不宜太多，氨水必须新鲜，逐滴加入浓氨水，一边滴加一边摇匀震荡，以严格控制所滴加的浓氨水剂量。氨水若滴加过量，会不同程度地降低氨银液染色敏感性，使网状纤维染色过浅，氨过量也易导致脱片，以边滴加边摇动，直至溶液只有少量微颗粒为佳。

图1 A、B 两组染色结果比较。A，背景见多量沉渣、清洁度较差，网状纤维（黑箭头）清晰度较差，网状纤维与胶原纤维（红箭头）对比度差；B，背景见未见明显沉渣、清洁度好，网状纤维（黑箭头）清晰度好，网状纤维与胶原纤维（红箭头）对比度好，肝血窦内皮下网状纤维呈黑色，汇管区胶原纤维呈棕红色；比例尺，100μmFig.1 Comparison of staining results between 2 groups. A, traditional staining method showed a lot of sediment and poor background cleanliness, low clarity of reticular fi ber, poor contrast between reticular fi ber (black arrow) and collagenous fi ber (red arrow); B, improved new method showed no obvious sediment, cleaner background, higher clarity of reticular fi ber, good contrast between reticular fi ber (black arrow) and collagenous fi ber (red arrow); scale bar, 100μm

由于传统网状纤维染色方法存在诸多缺点，其主要原因如下：①高锰酸钾是强氧化剂，0.25%高锰酸钾水溶液氧化时间过长是染色过程易脱片的重要原因；②高锰酸钾水溶液氧化后续的蒸馏水洗、草酸水溶液漂白、蒸馏水洗时间过长也是染色过程易脱片的原因；③2%硫酸铁铵水溶液媒染后，自来水洗后再蒸馏水洗，蒸馏水冲洗不彻底时，自来水残余的氯离子会与金属银反应而导致网状纤维清晰度差、网状纤维与胶原纤维对比度差，甚至导致脱片；④直接滴加Gomori氏氨银溶液在切片上及其后的蒸馏水冲洗方法欠佳，导致切片背景银颗粒沉渣多，也影响切片染色质量；⑤10%甲醛溶液还原时间过长易导致脱片；⑥0.2%氯化金溶液调色过度导致网状纤维清晰度欠佳、网状纤维与胶原纤维对比度欠佳。针对传统网状纤维染色背景不清晰、染色过程易脱片、网状纤维清晰度欠佳、网状纤维与胶原纤维对比度欠佳等问题，我们对传统染色方法进行了持续改进，主要措施包括：调整部分染色步骤的作用时间；整个染色过程避免使用自来水冲洗；裁剪略大于组织的滤纸铺于组织上，氨银液染色步骤结束后不直接倾倒掉液体而是以蒸馏水直接冲洗；氨银液染色后以蒸馏水速洗后即刻滴加10%甲醛溶液还原；由于蒸馏水洗有分化作用，时间应控制好，否则易染色浅淡；以甲醛分析纯溶液和蒸馏水按1:9的比例配制10%甲醛溶液；氯化金调色步骤以肉眼观组织由棕黄色变灰黑，再镜下控制等等。其中较为关键的染色技巧是：裁剪略大于组织的滤纸铺于组织上，再滴加氨银液覆盖滤纸表面10～15min，至滤纸表面形成一圈肉眼可见的银颗粒为宜，如果银颗粒不明显，可适当延长染色时间，用滤纸的效果是背景干净无沉渣。

我们的实践证明，改进网状纤维染色氨银液配制方法、改进网状纤维染色方法，可提高氨银液配制的成功率，延长氨银液有效期，提高网状纤维的染色质量，减少网状纤维染色的脱片率。

[1] 聂艳红，王红霞，刘慧，等. 网状纤维染色及P504S在胰腺实性假乳头状瘤鉴别诊断中的价值．临床与实验病理学杂志，2016，32（7）：799-801.

[2] 孙志华. 基于JCI核心理念的ICU患者安全目标持续改进的护理实践.中华现代护理杂志，2015，21（24）：2912-2915.

[3] 田媛媛，唐正利. 我院ICU多重耐药菌感染管理实践. 中华医院管理杂志，2017，33（1）：56-57.

[4] 王德田，董建强. 实用现代病理学技术. 北京：中国协和医科大学出版社，2013:91.