紫苏叶发酵饮料及蒸馏酒的研制

李　明，任丽丽，王　雪

紫苏叶为一年生、直立草本唇形科植物紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.的叶［1］.《中国药典》记载，紫苏叶味辛、性温、归肺、脾经，具有解表散寒、行气和胃的功能，用于风寒感冒、咳嗽呕吐、妊娠呕吐、鱼蟹中毒［2］.现代药理学研究表明，紫苏叶具有抗过敏、抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、抗皮肤衰老等多种功能［3-5］.此外，紫苏叶营养丰富，蛋白质含量高达25%，含多种人体所需微量元素及16种人体所需氨基酸，其中包含7种人体必需氨基酸，微量元素中钙和磷含量较高［4］.以紫苏叶为原料提取功能性成分一直受到研究者的关注［6］.从紫苏叶中提取挥发油［7］、迷迭香酸［8］、功能性多糖［9，10］、黄酮类化合物［11，12］、花色苷［13］等相关研究已有报道.紫苏叶是传统的药食两用植物，广泛应用于医药行业，目前，市场上以紫苏叶为主要原料的食品很少，但紫苏叶食品的研究却一直受到研究者的关注.紫苏油［14］、紫苏乳饮料［15］、紫苏复合饮料［16-18］、紫苏保健食品［19-22］、紫苏醋［23］、紫苏果酒［24］、紫苏酱［25］等食品已有研究.本研究以紫苏叶为主要原料，采用生物发酵法制作紫苏叶发酵饮料及紫苏叶蒸馏酒，并对其风味成分进行了初步检测，以期丰富紫苏食品种类，促进紫苏资源的开发与利用，提高紫苏的产业价值.

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

1.1.1主要材料

紫苏叶（采自内蒙古呼和浩特市赛罕区金河镇七圪台村现代农业生态园）、酵母（富门伯恩，瑞典）、白砂糖（市售）.1.1.2主要试剂

盐酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、硫酸酮、氯化钠、葡萄糖等均为分析纯.

1.2　主要仪器与设备

FA2004型电子天平：上海市安亭电子仪器厂；HH-S型数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；SLI-700型电热恒温培养箱：上海安亭科学仪器厂；ISQ气相色谱-质谱仪：ThermoFisher中国有限公司.

1.3　方法

1.3.1工艺流程

工艺流程见图1.

图1　工艺流程

1.3.2单因素实验

实验中以发酵结束后的酒精含量、残糖含量和感官评分为指标，分别考察了酵母接种量、发酵温度、白砂糖用量、料液比四个因素对紫苏发酵饮料品质的影响.

（1）酵母接种量对紫苏叶发酵过程及风味的影响.固定料液比为1∶16，白砂糖添加量为20%，发酵温度为20℃，发酵时间为15d，当酵母添加量分别为0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰时，考察酵母添加量对紫苏叶发酵过程及风味的影响.

（2）发酵温度对紫苏叶发酵过程及风味的影响.固定料液比为1∶16，白砂糖添加量为20%，发酵时间为15d，酵母添加量为1.5‰，当发酵温度分别为16℃，20℃，24℃，28℃，32℃和36℃时，考察温度对紫苏叶发酵过程及风味的影响.

（3）白砂糖用量对紫苏发酵饮料及风味的影响.固定料液比为1∶16，发酵温度为20℃，酵母添加量为1.5‰，发酵时间为15d，白砂糖添加量分别为10%、15%、20%、25%，30%时，考察不同的白砂糖用量对紫苏叶发酵过程及风味的影响.

（4）料液比对紫苏发酵饮料及风味的影响.固定酵母添加量为1.5‰，发酵温度为20℃，发酵时间为15d，白砂糖添加量为20%，料液比分别为1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，1∶64时，考察不同的料液比对紫苏叶发酵过程及风味的影响.1.3.3正交实验

通过上述单因素试验结果，以感官评分为指标，设计四因素三水平L9（34）正交试验，确定最优工艺条件，正交试验设计表见表1

表1　发酵条件优化设计表

1.3.4测定方法与评价标准

（1）酒度测定.酒度的检测依据GB/T 15038-2006葡萄酒、果酒通用试验方法.

（2）残糖含量测定.残糖含量测定依据GB/T 5009.7-2008食品中还原糖的测定方法.

（3）香气成分测定.蒸馏酒样品用煮沸冷却后的超纯水稀释至10%vol，吸取8mL置于20mL顶空瓶中，加氯化钠至饱和，进行HS-SPMEGC-MS分析.紫苏发酵饮料取样后直接进行HS-SPME-GC-MS分析.

HS-SPME条件：采用DVB/CAR/PDMS的三相萃取头，样品在50℃下预热5min，萃取吸附45min后直接进样，250℃下GC解析5min.利用GC-MS对样品进行分析.

气相色谱质谱（GC-MS）分析法的色谱分析条件：

GC条件：SE-54型石英毛细管柱（0.25mm*30m），进样温度250℃，采用程序升温，32℃保持3min，2℃/min升温至50℃，保持2min，再以4℃/min升温至230℃，保持8min，进样口温度为250℃.用高纯氦气作载气，流速1mL/min.

MS条件：EI电离源，离子源温度230℃，电子能量70eV，扫描范围35.0～350.0amu.

（4）感官评价标准.由10人组成的品评小组，根据表2紫苏发酵饮料感官评价标准对产品感官品质进行打分.

表2　紫苏发酵饮料感官评价标准

2　结果与分析

实验过程中，通过测定残糖含量和酒精含量，考察紫苏叶在不同发酵条件下的发酵特点.同时，由于发酵过程中，紫苏叶发酵汁的风味决定了发酵饮料的风味及蒸馏酒的香气，因此，研究中以感官评定作为辅助手段，考察不同发酵条件下紫苏叶发酵汁的风味，以确定紫苏叶发酵饮料的最佳制作条件.

2.1　酵母添加量对发酵及风味的影响

由图2可知，随着酵母添加量的增加，当发酵结束后，各样品残糖含量随酵母添加量的增加而不断下降.这是因为当酵母添加量不断增加时，酵母在生长繁殖时所消耗的白砂糖的量也在不断增加.当酵母添加量在0.5‰～1.5‰时，随着酵母添加量的增加，酒精含量随之上升.当酵母添加量超过1.5‰时，酒精含量反而开始下降.

图2　酵母添加量对发酵的影响

由图3可知，当酵母添加量在0.5‰～1.5‰范围时，发酵汁的感官评分不断上升.当酵母添加量超过1.5‰时，发酵汁的感官评分开始下降，这主要是因为当酵母添加量在0.5‰～1.5‰范围时，随着酵母添加量的增加，发酵过程中的酒精含量及风味物质的含量不断上升，使发酵汁的感官评分不断上升.但当酵母添加量过高时，导致发酵汁中出现令人不悦的酵母味，从而使感官评分下降.

图3　酵母添加量对风味的影响

2.2　发酵温度对发酵及风味的影响

由图4可知，随着发酵温度的升高，残糖含量不断下降，这主要是因为，随着初始发酵温度的提高，酵母细胞中的各种生化反应速度加快，酵母代谢活动旺盛，糖分被大量消耗，导致残糖含量不断下降.

图4　发酵温度对发酵的影响

当发酵温度由16℃升至20℃时，酒精含量随发酵温度的上升而增加，达到20℃时酒精含量最高，当发酵温度超过20℃时，酒精含量随发酵温度的上升反而开始下降.这主要是因为，当发酵温度在16℃时，由于发酵温度低，酵母生长和繁殖速度慢，导致残糖含量较高，酒精含量低.当发酵温度高于20℃时，酵母细胞中的各种生化反应速度不断加快，酵母代谢旺盛，在发酵初期糖分消耗过快，导致残糖含量下降的同时，酒精含量也不断降低.

由图5可知，发酵汁的感官评分随发酵温度的提高先升后降，当发酵温度为20℃时，感官评分最高.这可能是因为，当发酵温度较低时（16℃），发酵缓慢，鲜紫苏叶原有的味道过重，令人产生不适.当发酵温度较高时（＞20℃），酵母代谢过快，呈香物质没有充分形成，甚至由于发酵过快出现微苦的滋味，导致感官评分不断下降.在发酵温度为20℃，发酵汁中不仅具有紫苏叶特有香气，而且香气更加柔和、悦人，感官评分最高.

图5　发酵温度对风味的影响

2.3　白砂糖添加量对发酵及风味的影响

由图6可知，随着白砂糖添加量的不断增加，残糖含量不断上升.但酒精含量随白砂糖添加量的增加先升后降.这可能是因为，当白砂糖的添加量达到25%～30%范围时，白砂糖浓度较大，发酵液渗透压较高，抑制了酵母的活性，导致酒精含量下降，残糖含量也显著上升.

图6　白砂糖用量对发酵的影响

由图7可知，发酵汁的感官评分随白砂糖添加量的增加先升后降.这主要是因为当白砂糖添加量在5%～20%范围内时，随白砂糖添加量的增加，酵母发酵环境更加适合，风味成分更加丰富，达到20%时，感官评分最高.当白砂糖添加量达到25%～30%范围时，由于酵母活性受到抑制，香气成分没有充分形成，同时发酵汁的残糖含量较高，口感不适，导致感官评分下降.

图7　白砂糖用量对风味的影响

2.4　料液比对发酵及风味的影响

由图8可知，当料液比在1∶4～1∶16的范围内变化时，残糖含量不断下降，酒精含量不断上升.当料液比在1∶16～1∶64的范围内变化时，残糖含量和酒精含量不再发生明显的变化.这可能是因为紫苏叶本身具有一定的抑菌作用，当料液比在1∶4和1∶8时，紫苏叶所占比重较大，汁液较浓，抑制了酵母的活性，导致残糖含量较高，酒精含量较低的结果.当料液比在1∶16～1∶64时，紫苏叶所占比重小，紫苏叶浸出物对酵母的抑制作用显著降低，使酵母能够正常生长和繁殖，在酵母和白砂糖添加量固定的前提下，残糖含量和酒精含量的变化不显著.

图8　料液比对发酵的影响

由图9可知，料液比在1∶4～1∶64的范围内，感官评分先升后降，在料液比为1∶16时达到最高.这主要是因为，当料液比为1∶4和1∶8时，紫苏叶含量较高，紫苏特有的风味过重，令人不适.当料液比为1∶32和1∶64时，紫苏叶比重过低，紫苏特有的风味不突出，导致感官评分下降.

图9　料液比对风味的影响

2.5　正交实验结果

在单因素实验结果的基础上，对酵母添加量、发酵温度、白砂糖添加量和料液比四个因素按照L9（34）设计正交试验，实验结果见表3.

表3　发酵条件优化实验结果

由表3极差R大小，可知影响发酵因素的主次顺序为：C（白砂糖添加量）＞D（料液比）＞B（发酵温度）＞A（酵母添加量），采用直观分析法，可得最优工艺条件组合为：C2D2B2A2，即初始白砂糖添加量为20%、料液比为1∶16、发酵温度为20℃、酵母添加量为1.5‰.在此条件下进行3次验证试验，所得产品感官评分的平均值为91分，表明C2D2B2A2为最优组合.

2.6　紫苏叶发酵饮料及蒸馏酒香气成分分析

紫苏发酵饮料及蒸馏酒的主要香气成分的气质色谱总离子流图见图10，各组分鉴定的结果见表4.

表4　紫苏叶发酵饮料及蒸馏酒香气成分鉴定结果

由表4可知，采用GC-MS技术在紫苏叶发酵饮料样品中共鉴定出24种香气成分，这些成分主要是酯类10种、醇类2种、酸类4种、其他类8种，分别占41.67%、8.33%、16.67%、37.5%.在紫苏叶酒样中共鉴定出9种香气成分，这些成分主要是醇类2种、酯类3种、酮类2种、其它类2种，分别占22.22%、33.33%、22.22%、22.22%.

图10　紫苏叶发酵饮料（a）及蒸馏酒（b）香气成分的GC-MS总离子色谱图

由香气成分的分析结果可知，在两种样品的香气成分中，酯类物质所占比重都是最高，其中辛酸乙酯含量最多，在发酵饮料及蒸馏酒中的比重分别为17.54%和7.38%.有研究表明，发酵酒香气的主体香气物质为四大酯类（乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯与乙酸乙酯）与两大醇类（异戊醇与异丁醇）［26］.结合本实验结果可初步得出，辛酸乙酯对紫苏叶发酵饮料及蒸馏的香气贡献较大，并与其他酯类、醇类、酸类等化合物共同作用形成了紫苏发酵产品的独特香气.另外，通过与发酵饮料香气成分的结果对比可知，蒸馏酒的香气成分在种类、数量及含量上都发生了变化，尤其是在香气成分的数量上远少于发酵饮料.原因可能有两个方面：一是在蒸馏酒制备过程中，加热处理使发酵液的温度逐渐上升，在温度不断变化的过程中及高温蒸馏期间，发酵液中发生的复杂生化反应使香气成分发生了改变；二是在蒸馏过程中香气成分可能出现损失.在蒸馏前后，香气成分的改变机制还有待于进一步的深入研究.

3　结论

对紫苏叶发酵饮料及其蒸馏酒制作条件的优化结果表明，最佳发酵条件为：料液比为1∶16、发酵温度为20℃、初始白砂糖添加量为20%、酵母添加量为1.5‰.此条件下制作的紫苏叶发酵饮料感官品质、发酵效果最佳，口感纯正、适宜饮用，所得蒸馏酒具有紫苏叶特有的香气.采用顶空固相微萃取（HS-SPME），通过GC-MS分析紫苏叶发酵饮料的香气成分，初步鉴定出24种化合物；紫苏叶蒸馏酒的香气成分初步鉴定出9种化合物.

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