纳米氧化亚铜的制备及其抑菌性研究

杨步君，于少明

（合肥工业大学化学与化工学院，安徽 合肥 230009）

氧化亚铜禁带宽度为2.2eV，是一种典型的金属缺位p型半导体。因其独特的晶体结构、禁带宽度，氧化亚铜具有光学性能、磁学性能、催化性能、传感性能[1-2]。此外，氧化亚铜还具有很好的抑菌性能，可应用在海洋防污、抗菌纺织品、污水治理等领域[3-4]。

由于氧化亚铜的生产成本较低，抑菌效果好，因而备受研究者的关注。Pang等[5]合成了不同形貌的氧化亚铜并研究了其抗菌活性，结果表明，立方体氧化亚铜的抗菌活性具有广谱性，而八面体氧化亚铜的抗菌活性具有高选择性。Lee等[6]合成了具有{111}晶面的八面体氧化亚铜和具有{100}晶面的立方体氧化亚铜，通过两者对大肠杆菌的抑菌性对比，发现后者的抑菌性较好，从而得出氧化亚铜{100}晶面在对大肠杆菌的抑制作用中发挥重要作用的结论。Jung等[7]采用溶剂热的方法合成了八面体、截断八面体、截断菱形十二面体等一系列形貌的氧化亚铜，在这些不同形貌的氧化亚铜中只有{111}和{110}两种晶面，通过对大肠杆菌的抑菌性对比，他们发现，{110}晶面的氧化亚铜比{111}晶面的氧化亚铜对大肠杆菌的抑菌性更好。Ren等[8]研究了{100}晶面的立方体和{111}晶面的八面体晶型的氧化亚铜对大肠杆菌的抑菌性，发现后者的抑菌性更好，电动电势测量证明了八面体氧化亚铜和大肠杆菌之间的静电作用比立方体氧化亚铜和大肠杆菌之间的静电作用更强，而这种静电作用有利于杀死细菌。

从上述讨论可以看出，形貌和晶面对氧化亚铜的抑菌性有很大影响，人们一直在对其进行研究，但结论并不一致，有些甚至相悖，因此可能还会有其他因素导致氧化亚铜抑菌性的差异，对此还需要进一步探究。基于此，本文采用简便易行的化学沉淀法制备了花簇状氧化亚铜，以大肠杆菌为受试菌种，通过平板菌落计数法和振荡接触法探究其与立方体氧化亚铜的抑菌性差异，进而探究影响氧化亚铜抑菌性能的主要因素，同时探讨了氧化亚铜的抑菌机制。

1　实验部分

1.1　试剂与仪器

氢氧化钠、五水硫酸铜、聚乙二醇2000、抗坏血酸、无水乙醇、氯化钠、二水氯化铜、乙二醇和葡萄糖，均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白胨（LP0042）、酵母浸粉（LP0021），购自英国 Oxoid公司；琼脂（BR），购自北京索莱宝科技有限公司。

SPX-250生化培养箱（上海跃进医疗机械厂）；ZWYR-2102C恒温振荡培养箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰安医疗机械厂）；D/MAX2500V X射线衍射仪（日本理学电机公司）；JSM-6700LV场发射扫描电镜（日本电子制造公司）；NOVA-2200e比表面和孔隙分析仪（美国Quantachrome公司）。

1.2　氧化亚铜的制备

将20mL 0.5mol/L硫酸铜溶液和0.1g聚乙二醇2000加入到250mL单口烧瓶中，磁力搅拌下，将0.5 mol/L 40mL氢氧化钠溶液加入到上述溶液中，搅拌30 min后加入50mL0.1mol/L抗坏血酸溶液，继续搅拌30 min。反应结束后离心分离得到氧化亚铜，用去离子水和无水乙醇洗涤数次后置于烘箱中，80℃下干燥2h[9]。

作为对比，依据本课题组之前的研究条件制备了立方体氧化亚铜[10]。

1.3　表征

采用D/MAX2500V型X射线衍射分析仪（Cu靶Kα射线作为发射源）对样品进行物相分析，测试电压为 40kV，电流为 100mA，扫描范围 2θ 为 10°～80°，扫描速度为5°/min；采用SU8020型扫描电子显微镜观察产品形貌与结构，点分辨率为2nm；加速电压为1～15 kV；放大率为×20～800000。

1.4　抑菌实验

1.4.1培养基配制

Luria-Bertani（LB）液体培养基：取10g NaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母提取物放入搪瓷缸中，加1L水，搅拌使其溶解，用NaOH溶液将pH调至7.0左右，分装在50mL锥形瓶中，用纱布、报纸和棉线包扎，并于121℃下灭菌20min。

LB固体培养基：在100mL LB液体培养基内加入1.2g琼脂，在封闭电炉上加热融化，稍冷后用NaOH溶液将pH调至7.0左右，分装在25mL锥形瓶中，加塞，包扎，并置于高压灭菌锅中于121℃下灭菌20min。

样品培养基：取2mg氧化亚铜加入到上述配制的LB固体培养基中，加塞，包扎，并与生理盐水（0.9%氯化钠溶液）、培养皿、道夫管、涂布棒等一起置于高压灭菌锅中121℃下灭菌20min。

1.4.2平板菌落计数法[11]

用75%酒精喷洒擦拭超净工作台台面，并在紫外灯下照射30min。然后在超净工作台上将上述样品培养基混匀趁热倒入表面皿中，冷却凝固备用。用生理盐水将活化后的大肠杆菌菌液梯度稀释至10-7，用移液枪吸取200μL稀释后的菌液注射在样品培养基上，并用涂布棒涂匀。在37℃恒温箱内培养24h后观察菌落数量。

1.4.3振荡接触法[12]

取2mg氧化亚铜放在锥形瓶中并标记，加入20mL生理盐水，加塞包扎，放入灭菌锅中121℃下灭菌20 min。取出放入超净工作台上，紫外灯照射下冷却，稀释三次至浓度梯度为10-7，从中吸取200μL加入到上述加入了氧化亚铜的生理盐水中，用纱布包扎放到37℃的恒温振荡培养箱中（振荡频率250r/min）培养。在氧化亚铜与大肠杆菌接触10、20和30min时取出锥形瓶，在超净工作台上，充分振荡混匀后，取出200μL溶液，在事先冷却好的盛有LB固体培养基的培养皿上涂布，标号，倒置放在37℃的恒温培养箱中培养24h后观察细菌生长情况。

2　结果与讨论

2.1　XRD

图1样品的XRD

图1（a）是作为对比的立方体氧化亚铜XRD图[10]，从图1（a）中可以看出，立方体氧化亚铜在衍射角2θ为 29.65°、36.54°、42.42°、61.58°、73.70°处有强吸收峰，对应晶面指数分别为（110）（111）（200）（220）和（311）。图1（b）是合成的氧化亚铜XRD图，由图1（b）可以看出，通过化学沉淀法在0.5mol/L NaOH浓度下合成的氧化亚铜在衍射角 2θ 为 29.70°、36.62°、42.52°、61.56°和73.80°处有衍射峰，对应晶面指数分别为（110）（111）（200）（220）和（311），与标准谱库氧化亚铜谱图（JCPDS05-667）一致，未出现铜或氧化铜的杂质峰，说明制得的氧化亚铜较纯。

2.2　FE-SEM

图2（a）是作为对比的立方体氧化亚铜扫描电镜图[10]，合成的氧化亚铜的扫描电镜如图2（b）所示。由图2（b）可知，在0.5mol/L NaOH浓度下合成的氧化亚铜呈花簇状，粒径约200nm；立方体氧化亚铜粒径约500nm。

图2　氧化亚铜的FE-SEM

2.3　BET分析

花簇状氧化亚铜和立方体氧化亚铜的比表面积如表1所示。通过对比可知，花簇状氧化亚铜的比表面积比立方体氧化亚铜的大。

2.4　抑菌性

表1　花簇状氧化亚铜和立方体氧化亚铜的比表面积

首先采用平板菌落计数法来考查两种氧化亚铜样品的抑菌性能。取2mg氧化亚铜配制各自的样品培养基，灭菌后分别涂布大肠杆菌，培养24h后的实验结果如图3所示。从图3可以看出，图（c）中的菌落数比图（b）中少，即比表面积大的花簇状氧化亚铜的抑菌性能比立方体氧化亚铜的抑菌性能好。

为了更加深入地考查样品抑菌过程，探究其抑菌机制，本文又采用振荡接触法，通过将两组样品与细菌接触不同时间来观察其抑菌效果。

图4是两种氧化亚铜样品分别和大肠杆菌溶液接触 10、20 和 30min 的实验结果。从图 4（a1）和图 4（b1）可以看出，大肠杆菌和样品接触10min时，图4（b1）的菌落数目较少，即花簇状氧化亚铜的抑菌效果比较好。我们知道二价铜离子也是有抑菌作用的[13]，但是氧化亚铜释放铜离子需要一个过程，10min时间很短，这时氧化亚铜抑菌应该主要是氧化亚铜本身的抑菌作用，因此氧化亚铜是直接接触抑菌机制，同时也说明在短时间的接触中花簇状氧化亚铜的抑菌性能优于立方体氧化亚铜。

从图 4（a2）和图 4（b2）可以看出，时间延长到 20 min时，与立方体氧化亚铜接触的大肠杆菌菌落数目大量减少，并且两种氧化亚铜样品培养基上存活的菌落数目接近，花簇状氧化亚铜的优势不再明显。分析原因可能是花簇状氧化亚铜的比表面积比立方体氧化亚铜的比表面积大很多，当样品和大肠杆菌接触时间较短（10 min），立方体氧化亚铜的比表面积小，和大肠杆菌接触不充分；而在20min时由于时间延长，立方体氧化亚铜得以和大肠杆菌充分接触，所以抑菌效果提高，与花簇状氧化亚铜相当。从图4（a3）和图4（b3）可以看出，在大肠杆菌和样品接触30min时，两个培养基上均无菌落生长。由此可见，适量的氧化亚铜和细菌接触足够的时间都可以把细菌全部杀死。综合整个实验过程来看，氧化亚铜是直接接触抑菌机制，比表面积大的氧化亚铜的抑菌性能好，这种优势在较短的接触时间内尤其明显。

3　结论

采用化学沉淀法制备了粒径约200nm、比表面积为7.764m2/g的花簇状氧化亚铜，通过平板菌落计数法和振荡接触法将其与立方体氧化亚铜进行对比，探究了比表面积对氧化亚铜抑菌性的影响并探讨了氧化亚铜的抑菌机制。结果表明，与细菌短时间接触中比表面积大的氧化亚铜抑菌性好，氧化亚铜是直接接触抑菌机制。

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