洪世忠,吴 虹
(安徽中医药大学,安徽 合肥 230012)
药物分析是研究和发展药品全面质量控制的“方法学科”和“眼睛学科”,在药品的质量控制、新药研究开发、药物代谢研究、手性药物分析等方面均有广泛应用[1]。随着药品质量的日益重视和我国自主创新药物研制的迫切需要,色谱分析和光谱分析以及它们的联用已成为最重要的分析方法,近年来发展十分迅速。本文综述了几种有应用前景的现代分析方法和技术,探讨了其应用原理、适用条件和分析性能及其在药物分析中的应用。
色谱法最早由俄国植物学家茨维特(Tsweet)在1903年发明并使用,他以碳酸钙为固定相装在色谱柱中,以石油醚为流动相由上向下洗脱,从而分离植物色素[2]。经过一个多世纪的发展,色谱法的很多理论、技术和方法都趋于成熟,如高效液相色谱和气相色谱,这些技术目前都在增强自动化,以及开发新的固定相和检测器。而近年出现的多种色谱方法,如毛细管电泳色谱和超临界萃取色谱都以各自的优点在药物分析中占据一席之地。
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)是目前药物分析中应用范围最广的一门分析方法,可用于高分子、极性、离子和热不稳定化合物的分离分析[3]。HPLC实质上是以液体为流动相的柱层析,测定的一般过程为:高压泵使溶剂瓶中的液体(流动相)流经进样器、色谱柱、检测器后成为废液排出;样品由进样器进入,随流动相进入色谱柱。样品中的各被测组分在色谱柱中依柱填料种类不同,按不同的色谱原理(如吸附作用、分配原理、离子交换、离子对及凝胶排阻等)产生差速迁移,在色谱柱中得到分离,由流动相先后携带出柱,再经检测器转变为电信号,输入记录器记录成色谱峰。目前,在药物分析工作中最常用的高效液相色谱法有超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC) 法和反相液相色谱(reversedphasehighperformanceliquidchromatography,RP-HPLC)法[4]。
1.1.1超高效液相色谱
超高效液相色谱(UPLC)的分离原理与传统的HPLC相同,由HPLC的速率理论范氏方程可知:色谱分离度随色谱柱填料颗粒粒径的降低而提高。当填料颗粒粒径减小到1.7μm时,理论板高度最小值区域会扩大许多,即表明在更宽的流量范围内,得到更高的柱效。UPLC正是通过对色谱柱填料颗粒粒径的改变来改善柱效,使其可以在不损失高分离度的前提下优化流速,提高分析速度[5]。
用UPLC法同时测定丹参注射剂中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A这六个主要化学成分,建立的方法快捷、准确、重复性好;在17min内完成1次色谱分析,各主要成分色谱峰之间有良好的分离度,六个成分的浓度和各自峰面积之间有着良好的线性关系;精密度、重复性及加样回收率的RSD均小于1.0%[6]。对西洋参中人参皂苷的主要成分进行UPLC法测定,发现西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1三个主要成分在8min内得到完全分离,并进行了含量测定,在不影响分离效果的前提下大大提高了人参皂苷Rg1、Re、Rb1的分析速度,同时减少了溶剂消耗。该研究表明,UPLC法可作为一种比传统HPLC法更为方便、可行的替代方法[7]。
虽然UPLC在药物分析中的应用为我们提供了便捷,但是由于仪器要在超出目前限度(42MPa)的压力下工作;仪器的系统体积要更小且对梯度洗脱下的性能不产生影响;对于峰宽只有几秒的色谱峰检测器要能高速检测出[8],所以在实际运用中小颗粒粒径色谱柱在技术上还有许多难点。
1.1.2反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱(RP-HPLC)和正相高效液相色谱的主要区别是流动相和固定相的相对极性,RP-HPLC固定相是非极性的(如C18、C8),而流动相是相对极性的水、甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂,以调节保留时间。RP-HPLC是一种选择性高、灵敏度高、较稳定的分离分析方法,能用于药物的定性定量分析[9-10]。
随着柱填料的快速发展,RP-HPLC的分析应用范围逐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品。为控制样品在分析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2~8,太高的pH值会使硅胶溶解,太低的pH值又会使键合的烷基脱落。作者收集了最近两年的几篇RP-HPLC法测定中药制剂中有效成分含量的文献,如表1。
表1 RP-HPLC在中药制剂有效成分测定中的应用
毛细管气相色谱法(capillary gas chromatography,CGC)技术的发展已经有50多年的历史,是一种相对成熟且应用极为广泛的复杂混合物的分离分析方法。用气体作为流动相,优点在于气体的黏度小,因而在色谱柱内流动阻力小;同时,气体的扩散系数大,组分在两相间的传质速率快,有利于高效快速分离。毛细管柱和填充柱的主要区别在于毛细管柱一般是不装填充剂的空心柱,又称开管柱,固定液相是涂渍或固定化在柱管内壁上的。这种开管柱的渗透性很高,固定液量很少,这就使毛细管柱具有柱效高,吸附性小,柱流失少,分离温度低和分析速度快的优点[19]。
CGC法多采用程序升温,以FID为检测器,内标法测定多组分含量[20-21]。近年来顶空气相色谱法[22]和全二维气相色谱法[23]在药物分析领域也展现出了优势和应用前景。
在药物分析过程中气相色谱法也有一定的局限:在没有纯样品条件下,对试样中未知物的定性和定量较为困难,往往需要与红外光谱、质谱等结构分析仪器联用。对于沸点高、热稳定性差、腐蚀性和反应活性较强的物质,气相色谱分析也较为困难。
毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC)是近年来综合了现代最新分离技术高效液相色谱和毛细管电泳的优势而发展起来的高效电分离微柱液相色谱技术[24]。CEC一般采用熔融石英毛细管,在柱内填充或在柱壁键合固定相,用高压直流电源(或加一定的压力)代替高压泵,即用电渗流(electroosmotic flow,EOF)驱动流动相,溶质依据它们在流动相与固定相中分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得到分离,既能分离中性物质,又能分析带电荷的组分。对中性化合物的分离类似于HPLC的分离过程,即由于在固定相和流动相之间,溶质的分配具有差异从而得到分离。当被分析的物质在流动相中带电荷时,一方面分配机理和中性化合物相同,另一方面自身电泳淌度的差异在物质的分离上也具有非常重要的作用。
CEC具有高柱效、高选择性、高分辨率及分离速率快(三高一快)、样品用量少、应用广泛的特点,已成为当今的研究热点。毛细管电色谱柱是电色谱分离的关键,根据固定相的形式,毛细管电色谱柱可分为填充柱、开管柱和连续床柱(整体柱)。整体柱制备简单,是具有发展前景的CEC柱,但实际应用有待提高[25]。采用溶胶-凝胶技术制备了具有高机械强度和良好通透性的毛细管硅胶整体柱,以国产大环内酯类抗生素去甲-万古霉素为手性选择试剂,对所制备的整体柱进行化学衍生,成功地制备了去甲万古霉素键合手性硅胶整体柱,在反相色谱条件下,多种不同结构类型的手性药物在所制备的色谱柱上获得了分离[26]。在CEC中,电压对于物质分离的选择具有直接影响,它是控制溶质保留和分离选择性较有效的操作条件[27]。
在药物分析研究中,CEC集中在分离与药物相关的杂质和手性药物,主要把中性药物和多环芳香化合物作为分析对象。随着毛细管电色谱技术的不断完善和提高,其将在生物技术、环境保护、农业化学、精细化工产品、食品工业等领域的分析中得到应用。
超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)是以超临界流体为流动相的色谱技术。超临界流体是温度和压力同时高于临界值的流体,亦即压缩到具有接近液体密度的气体。在临界点附近流体的物理化学性质随温度和压力的变化极其敏感[28-29]。在不改变化学组成的条件下,SFC能调节被分离物质溶解度而令其对不同物质分别进行溶解与分离,而这主要是通过对压力的控制来调节流动相的密度来实现的。SFC既可分析气相色谱法不宜分析的高沸点、高分子量、低挥发性和热不稳定性试样。比HPLC具有更快的分析速度、更高的柱效、样品的前处理更简单等特点,广泛用于分析氨基酸、胺类、芳香油、糖类等试样[30]。
SFC可弥补GC和HPLC在分析性能上的不足,但分离效能和分析速度介于两种色谱方法之间[31]。但是SFC不能分离GC分析的一些物质,如强极性、强吸附性、热稳定性差、难挥发的待测物质。
光谱法是利用电磁辐射与物质间发生相互作用所表现出的特征,对物质进行定性、定量和结构分析的方法。主要包括原子吸收光谱法、原子发射光谱法、荧光光谱法、核磁共振波谱法、质谱法、紫外和红外光谱法等。在新药的研制过程中,尤其是原料药的结构确证必须对其紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振谱以及X射线粉末衍射图谱的数据进行综合解析后确定。在药品的质量标准中,紫外分光光度法和红外分光光度法既已广泛用于药物的鉴别、杂质检查,又用于原料药或制剂的含量测定。
原子吸收光谱法(flame atomic absorption determination,AAS)是基于气态和基态原子核外层电子对共振发射线的吸收进行元素定量的分析方法。AAS法有着选择性好、灵敏度高、精密度高等优点[32]。人们已认识无机元素与中成药的疗效有密切相关,AAS法能很好地检测中药中的无机元素含量[33],在中药的现代化和中药质量标准的制订过程中发挥着很重要的作用。采用火焰原子吸收光谱法对二色补血草中不同部位金属元素的测定分析,从元素的角度为二色补血草药用研究及开发提供了实验数据[34]。采用火焰原子吸收光谱法对三尖杉中六种微量元素进行测定,结果表明,三尖杉中含有丰富的人体必需的微量元素,特别是Zn和Ca元素的含量较高[35]。
核磁共振是强磁场下电磁波与原子核相互作用的一种基本物理现象。核磁共振光谱(nuclear magnetic resonance spectrometry,NMRS)是利用磁共振成像设备,获得物质的磁共振光谱信息,并探测其含量变化的新技术。其定性测定几乎不具有破坏性,能同时提供样品的多组分信息,具有需要样品少,分析速度快和灵敏度高的特点[36],这些优点使NMRS成为在新药的研制中的重要方法之一,如药物结构的确证[37-38]、药物代谢产物的研究[39]和药物的筛选和设计[40]等方面,在药物分析领域中的应用正在逐步扩大[41-42]。有报道,采用NMRS对植物中药及其伪品进行区别,以正品植物中药的1H-NMR相对标准图谱为参照,只需比较所鉴别样品的1H-NMR谱就可以判断中药的真伪[43]。在定量分析方面,该方法准确、专属性高、简便快速、不破坏被测样品,可选择性地测定混合药物或制剂中的组分或药物的立体异构体。NMRS技术已在USP和BP中应用,USP(29)用NMRS法进行亚硝酸戊酯及其吸入剂的含量测定。
荧光光谱分析法是一些物质吸收紫外可见光辐射后,可发射电磁辐射,通过荧光测量,进行物质定量、定性分析的方法。许多有机药物分子都具有特征的荧光光谱。荧光分析法最主要的优势是灵敏度高[44-46],当对微量和痕量药物进行灵敏准确的检测时,荧光分析法显示出了极大的优越性,采用氢化物发生技术与原子荧光光谱法同时测定红景天胶囊中的砷和汞,就体现出该方法灵敏度高、干扰少、操作简便等优点,能获得较高的检出限和精密度[47]。
虽然荧光分析法有着很大的优越性,但是它只能测量能发射荧光的物质,对于不能发射荧光的物质,只能利用待测物的降解产物的荧光特性进行分析。
色谱和质谱联用技术是利用GC和HPLC的高分离效能预先将被测组分分离开,继而利用质谱的高灵敏性和专一性进行检测的分离分析技术[4],有高效液相色谱-质谱(high-performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)联用技术、气相色谱 - 质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用技术、高效液相色谱-核磁共振光谱(high-performance liquid chromatography-nuclear magnetic resonance spectrometry,HPLC-NMRS)联用技术以及毛细管电泳 -质谱(electrophoresis-mass spectrometry,CE-MS)联用技术等。
高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术集HPLC的高分离能力与MS的高选择性、高灵敏度、极强的结构解析能力和通用性、分析速度快于一体,已成为药品质量控制(包括药物中微量杂质、降解产物、药物生物转化产物的分析鉴定)、体内药物和药物代谢研究中其他方法所不能取代的有效工具[48]。
以盐酸洛哌丁胺为内标,采用HPLC-MS法测定人血浆中的阿立哌唑浓度,结果表明,本方法快速、灵敏、准确、简便,适用于人体内阿立哌唑血药浓度的测定[49]。建立HPLC-MS法测定Beagle犬血浆中十肽化合物(LXT-101)的浓度,可快速检测出低剂量肌注给药后犬体内的血药浓度,适用于临床前药代动力学研究[50]。采用HPLC-MS法对大蒜辣素提取物及其降解产物进行研究,经过MS的结构鉴定,结果表明,大蒜辣素提取液中主要含有5种硫代亚磺酸酯类成分,水溶液于-20℃存放3个月,各成分相对稳定,而随着乙醇浓度增加,可见明显的降解[51]。
HPLC-MSn在中药指纹图谱研究中具有应用范围广、信息量丰富、所得总离子流图特征性强等优势,但在方法的重现性方面不如液相色谱,还需进一步研究。
气相色谱-质谱联用(GC-MS)法是将气相色谱和质谱的优点结合,使待测组分的分离和鉴定同时完成,具有灵敏度高、分析速度快、鉴别能力强等特点,对于定性定量分析多组分混合物中未知组分[52]、判别化合物的分子结构、测定化合物分子量尤其适用,故可在测定生物样品和体液中药物和代谢物的痕量分析中有所应用[53-54]。
采用GC-MS法对郁金水蒸气蒸馏提取物和超临界提取物进行分析,采用面积归一法计算各组分的相对含量。在郁金水蒸气蒸馏提取物中,烯类、酮类、醇类的含量都比较高,含量最多的物质是左旋大栊牛儿-3,7(11),9-三烯-6-酮。而郁金超临界萃取物中,醚类占绝对多数,其次依次为酯类和烯类,含量最多的物质是细辛醚,实验结果为研究郁金的指纹图谱、建立质量标准以及合理开发它们奠定了一定的基础[55]。采用GC-MS法对艾叶中提取的挥发油进行化学成分鉴定,用归一法计算各组分的相对百分含量,结果分离得到54个化学组分峰,并确定出其中38个化学成分,占挥发油总数的78.92%,主要成分为7-乙基-1,4-二甲基-甘菊环烯(17.34%)、桉油精(10.37%)、β-柠檬烯醇(8.16%)、石竹烯(2.03%)等[56]。
近年来,HPLC-NMR联用已成为药物杂质鉴定、体内外代谢产物的结构鉴定、天然化合物筛选等领域最具价值的分析技术之一。与其他联用技术相比,HPLC-NMR联用更为优越之处在于其整个分离检测体系均为溶液态、非破坏性系统。促成HPLC-NMR联用的主要技术有灵敏的HPLC-NMR流通池、高动态范围信号采集、溶剂峰抑制。这些技术的发展使得HPLC-NMR测量的技术障碍已经逐步得到克服,已成为临床药物代谢研究领域中最有价值的分析方法之一。1992年首次报道了使用HPLC-NMR进行药物代谢研究:将服用了消炎药布洛芬的志愿者尿液冷冻干燥处理后,分别使用HPLC-NMR的连续流和驻流操作方式进行分析,并在驻流操作时作了二维谱,得到代谢产物的明确结构,从此HPLC-NMR技术在生物医药分析中的应用得到了迅速发展。
毛细管电泳-质谱(CE-MS)联用法是二十世纪90年代末期才发展起来的最新联用技术,其将毛细管电泳的高分辨与质谱的高灵敏相结合,主要特点是“三高一快”(高柱效、高分辨率、高灵敏度及分析速度快)。由于毛细管电泳法在分离分析方法中具有最高的分离能力,对于复杂成分微量样品的分离已体现出巨大的优势,为毛细管电泳的定性问题提供了有力的手段。但由于质谱仪的接口限制,只能用含有挥发性缓冲盐的背景电解质,严重影响了CE的分离效果。虽可用质谱萃取离子监测弥补,但毕竟影响了正常毛细管电泳CE峰的定性,这是目前CE-MS联用急需解决的问题。二十一世纪初CEC-MS联用仪的出现,由于CEC具有可以不用含有非挥发性缓冲液的流动相,仍具有高选择性及高分离能力的特点,尤其是整体柱的出现,有望解决上述难题。
CE-MS目前主要应用于生物大分子、蛋白质和肽的分析,中药分析也有报道,如生物碱类化合物。
免疫分析法的原理是被分析药物(Ag)和标记后的该药物(Ag*)与该药物的特异性抗体(Ab)竞争有限的结合部位,未标记药物(AS)的浓度决定于标记药物(Ag*)与特异性抗体(Ab)结合的量[57]。放射性同位素、酶、荧光物质或化学发光物质都可能是标记物,依据标记物的属性,测定其放射性、酶反应后的UV吸收和荧光强度,其特点是灵敏度高、特异性强和操作简便。
放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)是根据放射性核素测量的高度灵敏度和免疫学抗原抗体反应的高度特异性相结合的一种超微量分析方法,是最早建立的经典的免疫分析方法。尽管需要严格的废物处理手续及严格的实验室条件,目前仍被广泛使用。
该法的优点包括高灵敏度、强特异性、制备标记物较为容易以及容易检测出放射性强度等,在复杂样品中微量或痕量物质的分析中尤为适用,因而在体内药物分析中地位独特。以人重组白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)为抗原与放射物标记的抗体结合,采用放射免疫分析仪测出抗原-抗体-第二抗体免疫复合物的放射强度值,建立人重组IL-2药物浓度与复合物放射强度之间的关系曲线,根据此关系曲线得出人重组IL-2的含量,且相关辅料对测定结果无影响[58]。随着出现单克隆抗体以及不断巩固和发展固相化技术,人们在免疫分析技术上也不断取得重大进展,其中就有以被测抗原或被测物与标记的过量抗体的非竞争结合为基础的免疫放射分析的出现[59]。
酶免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)的原理与RIA相似[60],所不同的是,EIA以酶代替RIA中的放射性核素作标记,方法更简便和安全。采用抗原(药物)与抗体(为包被的微粒)进行反应,采用碱性磷酸酶作为标记物,测定移植患者术后全血中他可莫司的浓度,运用统计学方法对其稳定性进行评价,结果EIA法测定他可莫司血药浓度日内差、日间差和两年中随行质控的变异系数均符合中国药典生物样品检测规定,表明EIA法在长期的临床应用中稳定、准确和可靠[61]。
化学发光免疫分析(chemiluminescence immune assay,CLEIA)法原理和其他标记免疫分析的原理相似,使用化学发光物质作为标记物,化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析和发光酶免疫分析法三大类。
采用直接化学发光技术检测人血浆B型钠尿肽(BNP),操作简便,敏感度高,特异性强,实验表明,BNP是一个很好的评价心衰患者心功能状态的实验室指标[62]。采用发光酶免疫分析法对用药达稳态浓度后,肾移植患者的肝素抗凝全血中的环孢霉素血药浓度进行测定,方法学指标均符合要求,表明发光酶免疫分析方法检测快速、准确、精密度高,对环孢霉素测定具有较高的特异性和稳定性[63]。采用电化学发光免疫分析技术检测136例正常健康男性、98例前列腺增生患者和99例前列腺癌患者血清中游离前列腺特异性抗原及其总量,并求出比值,然后进行统计学分析,再与前列腺在临床上的指征和影像学检查相结合,让前列腺癌的诊断率显著提高,缩短了临床上治愈前列腺癌的时间[64]。
荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)是一种新型的竞争性免疫分析方法,在反应液中标有荧光素的抗原和抗体竞争反应,当体液中药物浓度高时,标记抗原与抗体结合减少,降低了荧光偏振程度;而当体液中药物浓度低时,标记抗原与抗体结合增多,增强了荧光偏振程度,利用荧光偏振程度与待测药物浓度成反比的关系进行定量。其优点包括反应速度快、高效率及低成本[65],在小分子检测领域中优势明显,已初步应用于药物检测领域之中。比较FPTA与HPLC监测注射用替考拉丁在临床剂量调整中的应用,尽管两种方法都可用于测定替考拉丁,但是HPLC不适合在日常临床中应用[66]。
虽然FPTA在免疫分析中是一种优越的分析方法,但它也有缺点[67],示踪剂虽能为FPTA提供准确的检测信号,但它在一定条件下易受到光散射的影响,导致测量结果偏差,应尽量避免该干扰,或开发出更稳定的示踪剂。
药物高通量筛选(high throughput screening,HTS)分析技术是一种新方法,它是在不断积累的药物研究经验和不断进步的科学技术,如分子生物学、分子病理学、分子药理学、微电子技术等学科发展的基础上发展而来。其可以每天检测分析几千甚至数万样品的药物活性。不仅药理活性是其分析对象,同时药物代谢动力学性质以及不良反应等也包括在内。其中微孔板是极大多数高通量筛选分析方法的基础,同时加上细胞采集设备、样品转移、冲洗、孵育、离心等设备、信号检测及数据处理等高度自动化的操作设备。
HTS的模型主要包括分子和细胞水平的特异性体外筛选模型。在HTS中使用最多的模型是在分子水平上的药物筛选模型。分子水平的药物筛选模型可以依据生物分子的类型而大体分为受体、酶、通道、基因和其他类型的模型。由于在药物作用上具有靶标明确的特点,药物作用机理的信息可以通过这些模型的应用而直接得到。被筛样品对细胞的作用可以从细胞水平药物筛选模型观察得到,但是其中能够将药物对细胞生长等过程的综合作用反映出来,而药物作用的具体途径及靶标并不能从中反映。
这些模型中报告基因测定是最重要的。而出现报告基因法是因为在药物作用中转录因子和基因表达相关因子是重要的靶标。如果把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连,转入细胞内,然后将酶活性的变化简单检测,化合物对转录因子和基因表达的作用性质和程度就能够得以反映,一般把这种能间接反映基因转录水平编码的某种酶基因称为基因报告法。
检测方法随着检测对象的变化而变化,基于荧光、发光或比色的检测技术、基于放射性的检测技术,以及ELISA、报告基因、双杂交技术等都是能够被使用的技术。自动化技术、直接测定信号不需要经过滤分离的“同质”技术、闪烁亲近测定法以及报告基因技术等,是实现高通量筛选分析的重要手段。
在多年的药物分析课程的实验教学过程中,我们清楚地认识到色谱分析和光谱分析是药品质量控制中最常用也是最重要的分析方法,已在药物及其质量控制中的鉴别、检查或含量测定各方面被广泛应用。同时在新药的研制和开发过程中,除了色谱分析和光谱分析技术外,两者结合的联用技术更是必不可少,发展非常迅速。现代药物分析方法与技术为现代药学的发展提供了适时而有效的辅佐和动力[68]。多年来,教师们从以下两方面注重教学内容不断更新和教学方法的改革:
(1)加强实验教学内容的优化设计。对药物分析实验教学内容进行多次增减,调整后的实验内容分为验证性实验、综合性实验、设计性和创新性实验这三个层次。增加综合性和设计性实验开设数量。
(2)完善实验教学的综合考核制度。实验课的出勤、实验的预习、实验操作技能水平、实验结果和实验报告都是实验成绩的一部分,可综合进行形成性评价(即过程评价)。此外,还对三个层次的实验给予不同的权重系数,各次实验成绩根据权重系数进行换算,得出实验成绩。实验成绩占总成绩的30%。
[1]郑开逸,胡育筑.药物分析技术在药物安全预警中的作用[J].药物进展,2008,32(5):217.
[2]李发美.分析化学[M].北京:人民卫生出版社,2003.
[3]盛龙生,何丽一,徐连连,等.药物分析[M].北京:化学工业出版社,2002.
[4]赵香兰.临床药代动力学[M].郑州:郑州大学出版社,2003.
[5]Nováková L,Matysová D,Solich P.Advantages of Ultra Performance Liquid Chromatographyover High-performance Liquid Chromatography:Comparison of Different Analytical Approaches DuringAnalysis ofDiclofenac Ge1[J].Talanta,2006,68(3):908.
[6]李耿,辛文峰,杜金行,等.UPLC法同时测定丹参注射剂中6个成分的含量[J].药物分析杂志,2008,28(12):2021.
[7]杨立伟,郑传奇,蒋忠军.超高效液相色谱法测定西洋参中人参皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量[J].中药材,2008,31(1):55-57.
[8]AN Rong,BO Mei Ping.Ultra-performance Liquid Chromato-graphy Coupled with Mass Spectrum Detector Technology:Dramatically Improve the Quality of Result on Residues and Their Metabolites Analysis in Food and Agro-products[J].Mod Sci Instr,2006(1):20.
[9]Shixin Deng,Brett J.West C.Jarakae J,Simla B,et al.Development and Validation of an RP-HPLC Method for the Analysis of Anthraquinones in Noni Fruits and Leaves[J].Food Chemistry,2009,116:505-508.
[10]Ranjane PN,Gandhi SV,Kadukar SS,et al.Simultaneous Determination of Cefuroxime Axetil and Ornidazole in Tablet Dosage form Using Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography[J].Chinese Journal of Chromatography,2008,26(6):763-765.
[11]曾三平,丁野.RP-HPLC法测定夏桑菊颗粒中蒙花苷的含量[J].药物分析杂志,2008,28(12):2109-2110.
[12]王谨慧,靳子明,杨锡仓.RP-HPLC法测定展筋酊中红花黄色素 A的含量[J].中药新药与临床药理,2008,19(6):480-482.
[13]陈晖.RP-HPLC测定杞菊地黄丸(浓缩丸)中马钱苷含量[J].中成药,2009,31(1):154-155.
[14]陈晓颖,梁基智,梁从庆.RP-HPLC法测定冰蟾乳膏中马钱子碱和士的宁的含量[J].药学进展,2008,32(8):374-375.
[15]简晖,魏惠珍,杜艳龙,等.RP-HPLC法测定清脂六通丸中大黄素和大黄酚的含量[J].中药新药与临床药理,2009,20(1):49-50.
[16]翟学佳,邵青,程翼宇,等.RP-HPLC同时测定通脉口服液中4种活性成分的含量[J].药物分析杂志,2008,28(7):1087-1088.
[17]肖凌,聂晶,郭晨.HPLC法测定金青感冒颗粒中绿原酸的含量[J].中国药事,2009,23(1):68-69.
[18]贾薇,汪杰,曾元儿,等.RP-HPLC法测定白花银背藤药材中东莨菪内酯的含量[J].药物分析杂志,2008,28(10):1645-1646.
[19]刘文英.药物分析(第六版)[M].北京:人民卫生出版社,2008.
[20]徐国兵.GC法同时测定复方麝香注射液中薄荷脑、龙脑、百秋李醇和麝香酮的含量[J].中成药,2008,30(6):856-858.
[21]夏学军,金笃嘉,周翠萍,等.布格呋喃中有机溶剂残留量的毛细管 GC法测定[J].中国医药工业杂志,2008,39(8):617-618.
[22]李英华,吕秀阳,吕丽丽,等.顶空气相色谱法在药物分析中的应用[J].药物分析杂志,2005,25(11):1404-1408.
[23]邱涯琼,路鑫,许国旺.全二维气相色谱在药物分析中的应用[J].药物分析杂志,2008,28(3):498-505.
[24]袁瑞娟,王怀峰,刘丹宁,等.毛细管电色谱技术研究进展[J].化学进展,2006,18(9):1181.
[25]郭怀忠,毕开顺,孙毓庆.整体毛细管电色谱测定冬虫夏草中胞苷与腺苷的含量[J].中国中药杂志,2009,34(5):587-589.
[26]丁国生,唐安娜.去甲万古霉素键合毛细管电色谱硅胶整体柱的制备及应用[J].色谱,2006,24(4):402-406.
[27]杨瑞芬,冯枉持,达世禄.毛细管电色谱测定复方丹参注射液中原儿茶醛和原儿茶酸的含量 [J].中国药学杂志,2004,39(5):384.
[28]王学军,赵锁奇,王仁安.超临界流体色谱法分析大豆磷脂[J].色谱,2001,19(4):344-346.
[29]王学军,许振良,赵锁奇.银杏叶提取物中槲皮素和芦丁的超临界流体色谱法测定[J].中国医药工业杂志,2005,36(7):415-417.
[30]金灯萍,彭国平,陆晓峰.填充柱超临界流体色谱在中药中的分析与制备应用[J].中医药学刊,2006,24(3):541.
[31]武洁,冯芳.超临界流体色谱法分离手性药物[J].药学进展,2004,28(7):303.
[32]XU Wan-zhen, ZHANG Xing-hua,YAN Yong-sheng,et al.Flame Atomic Absorption Determination of Copper in Cereals Food Samples with the Preconcemtration of Potassium Tetratttanate Wisker[J].Chinese Journal of Reactive Polymers,2007,16(1-2):22-30.
[33]张奇凤,范玫玫,王官民,等.原子吸收法建立舒筋活血中成药的无机元素的控制方法的探讨[J].光谱学与光谱分析,2007,27(12):2595.
[34]吴冬青,李彩霞,安红钢,等.FAAS法测定二色补血草中不同部位的金属元素 [J].光谱学与光谱分析,2007,27(9):1848-1850.
[35]李银保,彭湘君,余磊,等.火焰原子吸收光谱法对三尖杉中六种微量元素的测定[J].时珍国医国药,2008,19(1):84-85.
[36]Silwood CJL,Lynch E,Claxson AWD and Grootveld MC.1H and13C NMR Spectroscopic Analysis of Human Saliva[J].Journal of Dental Research,2002,81(6):422-427.
[37]袁金伟,陈晓岚,屈凌波,等.克林霉素磷酸酯的波谱学研究[J].波谱学杂志,2008,25(4):523-525.
[38]李宁,李文,沙沂,等.多烯大环内酯抗生素——鲁丝霉素的结构解析[J].波谱学杂志,2008,25(4):514-521.
[39]ConnellyJC,ConnorSC,MonteS.ApplicationofDirectlyCoupledHigh-performance Liquidchromatography-NMR-MASS S pectometry and1H NMR Spectroscopic Studies to the Investigation of 2,3-Benzofuran Mmtabolism in Sprague-dawley Rats[J].Drug Metabolismand Disposition,2002,30(12):1357.
[40]胡红雨.核磁共振用于蛋白质抑制剂的筛选和先导药物的发现[J].药学学报,2002,37(2):158-160.
[41]陈阶,王中康,汪会荣,等.斑蝥素的提取及N-羧乙基斑蝥酰亚胺的合成[J].药物分析杂志,2009,29(1):25-30.
[42]夏圣安,刘慧浪,周志明,等.乌头碱对大鼠尿样代谢产物影响的 NMR 研究[J].波谱学杂志,2008,25(4):504-512.
[43]秦海林.核磁共振鉴别植物中药的研究[J].药学学报,1999,34(1):58-62.
[44]尚姝,杜迎翔,张锋,等.手性药物苯磺酸氨氯地平与人血清白蛋白相互作用的荧光光谱法研究 [J].中国药学杂志,2008,43(4):311-312.
[45]徐莉英,蔡蕍,王晓燕,等.甲磺酸培氟沙星的荷移反应荧光光谱法测定[J].中国医药工业杂志,2007,38(2):123.
[46]童蕾,王焰新,赵中一,等.氯氧化锆-氯化铵荧光光谱法测定葡萄糖共存下的果糖 [J].光谱学与光谱分析,2007,27(11):2313.
[47]赵志军,韩桂茹,常晓强.氢化物发生-原子荧光光谱法同时测定红景天胶囊中的砷和汞[J].中成药,2009,31(2):243-245.
[48]邵清松,胡润淮.高效液相色谱-质谱联用技术在中药研究中的应用[J].中医药学报,2007,35(3):44-46.
[49]原海燕,张毕奎,朱运贵,等.HPLC-MS法测定人血浆中的阿立哌唑[J].中国新药杂志,2007,16(22):1885-1887.
[50]孔爱英,张振清,乔建忠,等.HPLC-MS/MS法测定血浆中十肽化合物LXT-101及Beagle犬药代动力学研究 [J].药学学报,2008,43(9):946-950.
[51]王丽,宋敏,杭太俊,等.大蒜辣素提取物及其降解产物的HPLC-MS/MS研究[J].药学学报,2009,44(1):74-79.
[52]Safaei-Ghomi J,Ebrahimabadi AH,Djafari-Bidgoli Z,et al.GC/MS Analysis and in Vitro Antioxidant Activity of Essential Oil and Methanol Extracts of Thymus Caramanicus Jalas and Its Main Constituent Carvacrol[J].Food Chemistry,2009,115:1524-1528.
[53]田莉,刘江杰,高晓黎.生物样品中甘草酸及其代谢产物检测方法的研究进展[J].药物分析杂志,2009,29(2):340-344.
[54]胡玉熙,刘清飞,从文娟,等.气质联用技术在生物医药领域中的应用进展[J].药物分析杂志,2008,28(6):999-1005.
[55]陈湘,周明哲,王嗣岑,等.GC-MS分析郁金水蒸气蒸馏提取物和超临界提取物 [J].药物分析杂志,2007,27(12):1932-1936.
[56]徐新建,宋海,韩玉琦,等.艾叶挥发油化学成分的气相色谱-质谱联用分析[J].时珍国医国药,2007,18(11):2657-2658.
[57]白秀峰.生物药物分析[M].北京:中国医药科技出版社,2002.
[58]张玉,王凯玉,袁斌,等.放射免疫分析法测定重组人白细胞介素 -2 含量[J].中国医院药学杂志,2005,25(11):1019-1021.
[59]李好枝.体内药物分析[M].北京:中国医药科技出版社,2003.
[60]Su-Eon J,Jeong-Sook P,Chong-Kook K.Pharmacokinetics of Oral Calcitriol in Healthy Human Based on the Analysis with an Enzyme Immunoassay[J].Pharmacological Research,2009,60(1):57-60.
[61]魏筱华,易诚予,万子杨.微粒子酶免疫分析法测他可莫司血药浓度的稳定性[J].中国医院药学杂志,2007,27(10):1467.
[62]莫殿军,何述祥,张晓兰,等.化学发光免疫分析法检测B型钠尿肽在心力衰竭诊断中的价值 [J].国际检验医学杂志,2007,28(2):113-115.
[63]崔峰,任炜,薛建江.发光酶免疫分析法测定环孢霉素血药浓度[J].标记免疫分析与临床,2008,15(5):299-302.
[64]李雨升,董胜国,武风玉,等.电化学发光免疫分析F/TPSA比值对前列腺癌早期诊断的观察 [J].放射免疫学杂志,2007,20(5):58-59.
[65]Wang Zhan-Hui,Zhang Su-Xia,Shen Jian-Zhong,et al.Analysis of Sulfamethazine by Fluorescence Polarization Immunoassay[J].Chinese Journal ofAnalytical Chemistry,2007,35(6):819-824.
[66]Davani S,Bérard M,Royer B,et al.Comparison ofFluorescence PolarizationImmunoassayandHigh-performanceLiquid Chromatography Methods for Assay of Teicoplanin:Can Correlation be Improved[J].Pathologie Biologie,2004,52:584-588.
[67]S′anchez-Mart′Inez,ML.Aguilar-Caballos MP,Eremi SA,G′omez-HensA.Long-wavelengthFluorescencePolarization Immunoassay for Surfactant Determination[J].Talanta,2007,72:243-248.
[68]安登魁.现代药物分析选论[M].北京:中国医药科技出版社,2000.□