植物半胱氨酸可逆氧化修饰蛋白质组学技术研究进展

王 琳, 李 莹, 戴绍军, 喻娟娟*

(1.东北林业大学 盐碱地生物资源环境研究中心东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,黑龙江,哈尔滨 150040;2.上海师范大学 生命与环境科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234)

环境胁迫导致植物体内积累过量的活性氧分子(ROS),包括过氧化氢(H2O2)、羟自由基(•OH)、超氧阴离子(O2•-)和单线态氧(1O2)等[1].虽然适量的ROS可以作为信号分子参与胁迫信号转导,但是过量的ROS会对植物体内的生物分子(蛋白质、DNA、脂质等)和细胞结构造成氧化损伤.蛋白质中的半胱氨酸(Cys)残基含有富含电子的硫原子,是ROS介导氧化还原的敏感靶点之一[2].Cys可氧化修饰由ROS引发的二硫键(S-S)形成、S-谷胱甘肽化(-SSG)、S-磺胺化(-SN)、S-亚磺酰化(-SOH)、次磺酰化(-SO2H),以及S-磺酰化(-SO3H).其中,Cys氧化形成的S-S、-SSG和-SOH可以被相应的还原剂还原成游离巯基(-SH).这三种形式的Cys可逆修饰可以通过调节蛋白质构象影响蛋白质功能.因此,多数研究关注了植物中S-S、-SSG和-SOH等可逆氧化修饰[3].

近年来,逐渐发展起来的一系列氧化还原蛋白质组学技术为系统研究植物氧化还原修饰提供了重要手段[4].其中,差异烷基化技术是研究蛋白质Cys可逆氧化修饰的常用方法.该技术先利用N-乙基马来酰亚胺(NEM)或碘乙酰胺(IAM)等烷基化试剂封闭游离巯基,再利用还原剂如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)对已被可逆氧化修饰的Cys进行还原,进而应用不同试剂标记还原后新形成的自由巯基,并通过生物质谱鉴定氨基酸序列或Cys位点.因标记试剂不同形成了几种氧化还原蛋白质组学研究方法.本文作者对这些研究方法进行了综述.

1 基于荧光标记的双向电泳(2DE)技术

基于荧光标记的2DE分析技术应用能巯基特异结合的荧光试剂(如单溴二胺mBBr或吲哚乙酰氨基荧光素IAF)标记还原后新形成的自由巯基.其中,mBBr是一种应用最为广泛的荧光试剂,它能够稳定结合自由巯基,分子量小,对蛋白质分子量的影响较小,适合被应用于质谱分析.荧光试剂标记后的蛋白质通过2DE被分离,并可以在紫外光下的凝胶上呈现出荧光斑点.蛋白质斑点的荧光强度与mBBr的结合量存在比例关系,据此可以计算出蛋白质中Cys被氧化的程度.进而,通过mBBr信号与蛋白质丰度信号(经Ruby等染色剂获得)的比值可以判断蛋白质氧化还原水平的变化[5-7].

2DE是一种经典的蛋白质分离技术,该技术结果呈现方式直观、成本低廉,但是操作步骤繁琐,重复性不佳,对于特殊蛋白质(如极端等电点、极端分子量,和低丰度蛋白质)分离效果不好.尽管基于荧光标记的2DE技术可以检测蛋白质总体Cys氧化还原水平的变化,但无法对蛋白质中被修饰的Cys进行定量分析.

2 基于生物素-巯基特异性试剂标记的技术

2.1 基于生物素-巯基特异性试剂标记的2DE技术

基于生物素-巯基特异性试剂标记的2DE技术应用与生物素结合的巯基特异性试剂,如biotin-HDPD(N-[6-(biotinamido)hexyl]-3′-(2′-pyridyldithio) propionamide)或biotin-IAM/NEM/maleimide,可用于标记还原后新形成的自由巯基,从而使可逆氧化修饰的蛋白质Cys被生物素化.进而,利用可与生物素特异结合的链霉亲和素(streptavidin)或抗生素蛋白(avidin)柱子富集和纯化生物素化蛋白质,并通过2DE分离蛋白质.2DE凝胶上呈现的蛋白质斑点大小反映了Cys被氧化的蛋白质丰度[8].此技术与基于荧光标记的2DE技术类似,无法实现蛋白质中被氧化修饰Cys的定量分析.

2.2 基于生物素-巯基特异性试剂标记的同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术

应用生物素-巯基特异性试剂标记的可逆氧化修饰的蛋白质,也可利用iTRAQ技术进行定量分析.iTRAQ技术是美国AB SCIEX公司推出的一项蛋白质组学定量分析技术,其关键在于iTRAQ试剂.iTRAQ试剂是一系列小分子同重元素化学物质,由分子量不同的系列报告基团(分子量分别为113,114,115,116,117,118,119,121 u)、中性平衡基团和反应基团三部分组成[9-10].反应基团可以与蛋白质酶切后的多肽的氨基末端或赖氨酸侧链基团相连,从而实现对蛋白质多肽的标记;质谱检测到的报告基团的信号强度可以反映每个被标记的蛋白质多肽的丰度.另外,由于生物素-巯基特异性试剂可以与可逆氧化修饰的Cys共价连接,该技术可以对含有可逆氧化修饰的Cys进行定量分析.与2DE技术相比,iTRAQ技术具有更高的灵敏度、检测通量和重现性,能保证氧化还原多肽鉴定与定量分析的准确性.

3 基于同位素亲和标签(ICAT)标记的技术

基于ICAT标记的技术应用ICAT试剂与还原后新形成的自由巯基反应,可直接实现对蛋白质可逆修饰Cys的定量分析.ICAT试剂由反应基团、连接子和生物素亲和标签三部分组成.反应基团可特异结合肽链中Cys的自由巯基,而生物素亲和标签在ICAT标记多肽的分离纯化过程中起作用.因连接子中的氢/氘原子存在质量差异,ICAT试剂用“轻标”(连接子含有8个氢原子)和“重标”(连接子含有8个氘原子)加以区分,两者的质量相差8 u.标记蛋白质酶切后的多肽可经生物素-亲和素柱子进行富集和纯化,进而通过质谱鉴定分析[11].与iTRAQ试剂相比,ICAT试剂通过特异结合肽链中Cys的自由巯基实现定量,因此可直接被用于对氧化还原蛋白质的分析.此外,ICAT试剂自身具有生物素结合位点,可直接利用亲和素富集低丰度蛋白,有利于鉴定更多的可逆氧化修饰蛋白质.然而,ICAT试剂只含有两种标签,实验通量相对较低.此外,ICAT试剂分子量相对较大(约500 u),与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻,在质谱分析时标签仍保留在肽段上,导致肽段在碰撞诱导解吸附时,容易被片段化,造成质谱图复杂程度增加,尤其不利于低分子量多肽的分析.

4 基于巯基特异性串联质量标签(CysTMT/iodoTMT)标记的技术

基于CysTMT/iodoTMT标记的技术应用CysTMT或iodoTMT试剂与还原后新形成的自由巯基反应,直接实现蛋白质可逆氧化修饰Cys的标记.串联质量标签(TMT)技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术.TMT试剂由报告基团、平衡基团和反应基团三部分组成.TMT试剂的反应基团能与肽段氨基末端及赖氨酸侧链氨基共价连接,从而标记肽段.而在TMT试剂基础上发展起来的CysTMT和iodoTMT试剂只能与蛋白质中Cys的自由巯基结合,从而只标记含有Cys的多肽.CysTMT和iodoTMT试剂都包括6种质量报告基团,其分子量分别为126,127,128,129,130,131 u.CysTMT试剂的反应基团与Cys自由巯基的结合是可逆的,而iodoTMT试剂的反应基团与Cys自由巯基的结合是不可逆的.因此,与CysTMT试剂相比,iodoTMT试剂标记氧化修饰Cys的效率更高.经CysTMT或iodoTMT试剂标记的蛋白质被酶解为多肽后,标记的多肽可以通过anti-TMT抗体被富集和纯化,进而可通过质谱分析被鉴定[12].

CysTMT和iodoTMT试剂都可直接与Cys自由巯基结合,因此可直接用于对氧化还原蛋白质组学的研究.该技术利用anti-TMT抗体实现含有Cys肽段的富集,从而实现了对低丰度氧化还原修饰蛋白的鉴定.然而,尽管这两种试剂可以直接对蛋白质Cys的氧化还原水平进行定量分析,但是无法同时定量蛋白质丰度,导致无法准确判断蛋白质氧化还原水平的变化.

5 基于iodoTMT与iTRAQ联用(iodoTMTRAQ)的标记技术

为了解决同时定量蛋白质丰度与Cys氧化还原水平的问题,美国佛罗里达大学陈思学实验室发明了iodoTMTRAQ技术.该技术利用iodoTMT试剂标记Cys,同时利用iTRAQ试剂标记多肽氨基末端,实现同时检测Cys氧化还原水平和蛋白质表达丰度的变化[13-14],这是该技术独特的优势.然而,该技术仍然无法克服MS2串联质量标签分析带来的因前体离子干扰造成的标签丰度比率压缩问题.

6 结论与展望

近年来不断发展的氧化还原蛋白质组学技术为研究植物中蛋白质氧化还原稳态提供了更加完善的技术平台.在2DE凝胶分离技术的基础上,发展了非凝胶蛋白质分离技术(如纳升高效液相色谱与质谱联用技术),提高了蛋白质分离与鉴定的通量和重现性.同时,对蛋白质Cys的标记技术由最初的荧光试剂标记发展为同位素标签标记,提高了标记的灵敏度,实现了对Cys的精确定量.尤其是iodoTMTRAQ技术的出现,实现了对蛋白质丰度与Cys氧化还原水平的同时定量分析.这些技术已经被应用于植物发育与响应环境过程中蛋白质氧化还原修饰变化的分析[5-12,14].然而,上述技术虽然能同时标记与定量分析可逆氧化修饰的Cys(S-S、-SSG或-SOH),但是无法区分Cys的具体氧化形式.进一步开发能够标记和定量分析不同Cys氧化形式的高通量蛋白质组学技术,将有利于深入研究蛋白质氧化还原修饰参与调控的植物发育与环境应答机制.