鸭疫里默氏菌的耐药性及PCR检测技术

林彬彬 林志敏 莆田市农业科学研究所 福建莆田 351144

鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA），是一种属于黄杆菌科的革兰氏阴性菌，主要引起鸭、鹅、鸡、火鸡、野鸭等禽类急性或慢性败血症。鸭疫里默氏菌病，也称为鸭传染性浆膜炎，又名鸭疫巴氏杆菌病、新鸭病、鸭疫综合征、鸭败血症。该病多见于8周龄以下雏鸭，尤以2～3周龄雏鸭最易感，主要有樱桃谷鸭、番鸭、麻鸭等品种的鸭，可经呼吸道、消化道、皮肤伤口等感染而发病，尤以脚蹼伤口最易感。感染后临床表现为困倦、眼与鼻孔有分泌物、绿色下痢、共济失调和抽搐，慢性病例出现斜颈，病理剖检症状主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎，还可引起干酪性输卵管炎、脑膜炎、结膜炎和关节炎等炎症，导致禽肉品质下降，饲料报酬降低，生长周期延长等间接危害[1]。有研究表明，健康鸭存在带菌情况[2]。该病的病死率高，耐过及病愈鸭常出现生长发育迟缓，伴有神经症状而成为僵鸭，淘汰率高，给养鸭业带来严重的经济损失，已成为我国养鸭业重点预防的主要细菌传染病之一。鸭疫里默氏菌血清型众多，目前报道共有25个血清型，在我国主要以1型、2型和10型为主[3]，各个血清型之间缺乏有效的交叉保护，且血清型和致病性之间无相关性，甚至同一血清型不同来源菌株的致病性都存在差异。

目前，对鸭疫里默氏菌病的防治主要依靠疫苗和药物，但临床上用药的不规范，使得细菌耐药现象和药物残留问题日趋严重，由此引起的食品安全问题也越来越受到人们的关注。本文就鸭疫里默氏菌的耐药现状、耐药机制、分子生物学中PCR检测技术的国内相关研究进行阐述。

1 鸭疫里默氏菌的耐药现状

国内研究表明，我国鸭疫里默氏菌的耐药现象十分严重，主要表现为双重或多重耐药，并且因时间地点的不同，菌株的耐药性也存在一定差异。Zhong等[4]对1998-2005年我国部分地区分离的224株鸭疫里默氏菌进行耐药性监测，结果表明，所有分离菌株对β-内酰胺类药物显示高水平耐药；对阿米卡星、亚胺培南、头孢哌酮和新霉素的耐药率最低。张济培等[5]对珠三角地区分离的100株鸭源及鹅源鸭疫里默氏菌进行药敏试验，结果表明，63株菌株具有双重或多重耐药现象，93%菌株对庆大霉素耐药，97%菌株对奥格门丁敏感，其它药物敏感度依次为大观霉素、青霉素、环丙沙星、氨苄西林、链霉素、诺氟沙星、罗红霉素、磺胺甲恶唑、利福平和卡那霉素。程龙飞等[6]对2006-2012年福建省及邻近省份分离的423株鸭疫里默氏菌进行药敏试验，结果表明，所有分离菌株均对多种药物表现耐药性，50%以上菌株耐受的药物有多粘菌素B、卡那霉素、复方新诺明、林可霉素、四环素、克林霉素、利福平和氟哌酸，50%以上菌株敏感的药物有氟苯尼考、头孢拉定、头孢氨苄、阿莫西林、头孢唑啉和壮观霉素。雍燕等[7]对广东3个地区分离的16株鸭疫里默氏菌进行药敏试验，结果表明，所有分离菌株均对头孢类、氟苯尼考、阿莫西林高度敏感；对多西环素、大观霉素比较敏感；对恩诺沙星、新霉素、安普霉素存在不同程度的耐药。

1.1 耐药性产生的生化机制 主要有4种方式。

1.1.1 产生灭活酶 常见的灭活酶有灭活头孢类抗生素的β-内酰胺酶（水解酶）、灭活氨基糖苷类抗生素的钝化酶、灭活氯霉素的乙酰转移酶、灭活大环内酯类药物的酯酶和灭活林可霉素的核苷酸转移酶，可对进入细菌菌体内的抗生素进行修饰和水解而使其失去生物活性。蔡秀磊[8]首次在鸭疫里默氏菌中检测到 aadA5、aac6-II、catB3、aadAl四种不同的耐药基因盒，其中aadA5、aadA1基因编码核苷转移酶，介导对氨基糖苷类药物产生耐药性；aac6-II基因编码酰基转移酶，介导对氨基糖苷类药物的耐药；catB3基因编码氯霉素乙酰转移酶，介导对氯霉素产生耐药性。俞慧等[9]对构建的鸭疫里默氏菌强毒力和弱毒力菌株之间遗传差异表达基因文库经dotblot杂交和PCR验证，得到34个强弱毒株基因组差异片段，测定的序列经 BLAST、DNAStar和PSORTb分析，结果表明有1个片段所在基因编码β-内酰胺酶，与细菌耐药性有关。杨芳芳等[10]采用PCR方法对2005-2006年临床分离到的38株鸭疫里默氏菌进行 ant（3，，）-Ia、aac（6，）-Ib 和 aph（3，）-IIa三种氨基糖苷类钝化酶基因的检测表明，ant（3，，）-Ia、aac（6，）-Ib 和 aph（3，）-IIa 三种氨基糖苷类钝化酶基因在其实验室分离到的38株RA中已普遍存在，且多重耐药现象比较严重。

1.1.2 改变抗生素作用的靶位 抗生素作用的靶位（如核糖体和核蛋白）由于发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用以及抗生素作用的靶酶 （如青霉素结合蛋白和DNA促旋酶）的结构发生改变，使之与抗生素的亲和力降低。螺旋酶gyrA的喹诺酮类药物决定区（QDRD）的突变是喹诺酮类药物耐药菌株产生的主要原因[11]。孙亚妮等[12]对临床分离的31株鸭疫里默氏菌螺旋酶gyrA的喹诺酮耐药决定区进行克隆和序列分析，结果表明，30株诺氟沙星高度、中度耐药菌株均出现gyrA的基因突变，氨基酸发生改变，Ser83突变为Ile83/Arg83，Gly87全部突变为Asp87，而环丙沙星耐药菌株基因突变未发现明显的规律性。

1.1.3 降低外膜通透性，阻止或减少抗生素进入菌体 仲崇岳[13]测定了72株对苯唑西林、青霉素G和头孢吡肟耐药的鸭疫里默氏菌在加入抑制剂羰基氰间氯苯腙（CCCP）后的最小抑菌浓度（MIC），发现鸭疫里默氏菌对苯唑西林、青霉素G、头孢吡肟的耐药率依次下降，而经β-内酰胺酶表型和基因型检测均为阴性，但通过头孢吡肟诱导试验和外膜蛋白电泳发现在14.4～20 kD和45 kD处各有两条条带发生缺失，而诱导株加入CCCP后，MIC值只下降为原来一半，说明该诱导株对头孢吡肟的耐药性可能是由膜通透性降低引起的。

1.1.4 增强主动外排系统，把进入菌体的抗生素泵出菌体外 细菌中含有一种能量依赖性外排系统，可对抗生素主动泵出。仲崇岳[13]对经CCCP处理前后鸭疫里默氏菌对药物敏感性的变化进行研究，初步总结出鸭疫里默氏菌对氨基糖苷类、喹诺酮类和β-内酰胺类药物的耐药性与耐药泵介导的耐药有关。金龙翔[14]对25株临床分离的鸭疫里默氏菌对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星五种氟喹诺酮类药物的MIC值和同时加入CCCP后的MIC值进行比较，结果表明CCCP可使耐药菌对除左氧氟沙星外的药物的敏感性增强，提示主动外排在鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制中发挥了重要的作用。

1.2 耐药性产生的遗传机制 主要有2种方式。

1.2.1 基因突变 突变一般发生于染色体DNA，但也可发生于质粒DNA或转座子上的DNA。耐药菌株的形成是自发突变加上药物选择的结果。金龙翔[14]采用PCR方法对25株 RA的 gyrA、gyrB、parC、parE全基因分别进行测序，并分析其在喹诺酮耐药决定区的基因突变和氨基酸的替换情况，认为gyrA基因QRDR的点突变扮演了最主要角色，parE基因QRDR同时发生双位点突变很可能也发挥了一定作用。

1.2.2 外源耐药基因的获得 携带耐药基因的基因元件（质粒、转座子、整合子、噬菌体）通过转化、转导、接合等方式由供体菌转移到受体菌中，细菌获得外源耐药基因，形成耐药菌株或多重耐药株，耐药基因也因此在细菌间广泛传播。R质粒是与细菌耐药相关的DNA片段，可介导耐药基因在细菌间转移和交换，在细菌耐药性传播中发挥重要作用。转座子可在基因组中改变自身位置，携带耐药基因，利于细菌间耐药基因交换。整合子存在于质粒、转座子或染色体上，可随转座子在染色体和质粒间移动，可随质粒在细菌间转移。基因盒可以被切除和整合，在细菌多重耐药性的形成中发挥重要作用。杨芳芳等[10]利用PCR方法对38株RA中质粒介导喹诺酮类药物耐药的 qnr基因（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD 和 qnrS）和外排泵基因（QepA、oqxAB）分别进行检测和测序分析，结果表明，38株RA中由质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因仅检测到qnrS基因。邢琳琳[15]对1996-2014年实验室自临床病死鸭分离到的79株鸭疫里默氏菌及模式株ATCC11845进行红霉素最小抑菌浓度（MIC）试验和耐药性机制研究，结果表明，鸭疫里默氏菌多重耐药区 （MRR）中的ermF、ermFU或ereD基因可引起鸭疫里默氏菌的红霉素耐药，其中ermFU基因可能是来自CTnDOT转座子元件，ermF基因可能来自于转座子Tn4351。蔡秀磊[8]根据已知的Ⅰ型整合子序列，应用PCR方法对22株临床分离的鸭疫里默氏菌进行检测和测序分析，结果表明，所有分离菌株均为Ⅰ型整合酶基因阳性，1株菌株捕获了耐药基因盒aadA5，21株分离菌株顺次捕获了耐药基因盒aac6-Ⅱ、catB3和aadA1，证明了整合子结构是鸭疫里默氏菌耐药性传播的重要机制之一。

2 分子生物学中PCR检测技术的应用

临床上常根据临床症状和剖检变化对鸭疫里默氏菌病作出初步诊断，但还需对鸭疫里默氏菌进行分离鉴定才能确诊。不过在病原分离方面存在费时、费力、分离率不太高等不足，在血清学检测方面一次只能检测到一种血清型的鸭疫里默氏菌，若没有获得所有阳性血清，就会造成漏检。近年来，分子生物学检测技术迅速发展，以PCR技术的应用尤为广泛。不少学者也建立了基于鸭疫里默氏菌外膜蛋白基因ompA或16S rRNA的PCR方法来检测鸭疫里默氏菌病。胡青海等[16]建立了基于鸭疫里默氏菌ompA基因序列的PCR检测方法，可检测出1、2、6、10、14、15型和一株未定型的鸭疫里默氏菌菌株，可用于鸭疫里默氏菌的鉴定和快速诊断 （取脑组织）。谭秋杉[17]建立了基于鸭疫里默氏菌16S rRNA基因序列的PCR检测方法，可检测到在浙江省流行的1、2、10、11型4种主要血清型的RA标准株、临床分离株和病料样品，具有一定的普遍适用性。谢永福等[18]建立了基于鸭疫里默氏菌16S rRNA基因序列的巢氏PCR检测方法，可检测出1、2、10型和其实验室分离的未知型鸭疫里默氏菌菌株，具有早期检测雏鸭感染鸭疫里默氏菌的潜力。丁云竹等[19]建立了基于16S rRNA和danB基因序列的双重PCR检测方法，可检测出其实验室提供的 1、2、6、8、15型和其他未定型的鸭疫里默氏菌菌株，可对分离的RA疑似菌株进行快速检测和鉴定，也可以直接用于临床样品中RA的检测。程龙飞等[20]建立了基于大肠杆菌gapA基因、禽源多杀性巴氏杆菌KMT1基因、鸭疫里默氏菌OmpA基因序列的环介导间接PCR检测方法，可同时检测水禽3种常见病原菌（大肠杆菌、禽源多杀性巴氏杆菌、鸭疫里默氏菌），是一种特异性好、灵敏度高的快速病原学诊断方法。

实时荧光定量PCR技术，是在常规PCR技术的基础上，加入一条经标记的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术是在封闭的体系内完成检测，最终结果无需经过电泳检测，可有效避免样品间的交叉污染，有很高的敏感性、特异性强等优点，在鸭疫里默氏菌病上的应用也越来越多。段泽等[21]根据鸭疫里默氏菌荚膜多糖蛋白基因序列设计引物和探针，建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法，最低能检测到RA的DNA模板为2.0拷贝/μL，可用于鸭疫里默氏菌感染的快速诊断、流行病学调查和鸭产品的检疫等。谢永平等[22]根据鸭疫里默氏菌外膜蛋白（OmpA）基因保守区序列设计引物和探针，建立了直接检测RA的实时荧光定量PCR快速方法，最低能检测到RA的DNA模板为8.0拷贝/μL，可适用于RA的快速诊断、流行病学调查、种鸭引进隔离检疫、活鸭及其产品国内市场和进出口检验检疫。刘拂晓等[23]根据鸭疫里默氏菌16S rRNA基因保守区序列设计特异性引物和探针，建立了检测RA的荧光定量PCR方法，RA的DNA模板最低检测限可至1.0拷贝/μL，能很好地应用于RA的快速检测。万春和等[24]根据鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因（RaDtxR）为靶基因设计引物和探针，建立了检测RA的荧光定量PCR方法，RaDtxR基因最低检测下限为4.27×102拷贝/μL，可用于RA感染的早期检测，也可用于明确不同毒力RA在鸭只体内的动态载量，该方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好。

3 展 望

鸭疫里默氏菌病是目前危害养鸭业的主要细菌传染病之一，其造成的雏鸭死亡、僵鸭及鸭场的持续性感染使养殖户们遭受重大的经济损失。鸭疫里默氏菌血清型众多，再加上临床上用药不规范，使其耐药性情况越来越严重，耐药菌株越来越多，临床上易与大肠杆菌病等混合感染，导致对鸭疫里默氏菌病的防治和诊断也越来越困难。因此，有必要加强对鸭疫里默氏菌的耐药机制研究，建立快速、特异、简便的检测方法，为临床上快速诊断和合理用药防治鸭疫里默氏菌病提供依据。