基于直链淀粉衍生物手性固定相的高效液相色谱-串联质谱法拆分4种β-受体阻滞剂对映体及其分离机制的探讨

钱哲元,　张明勇,　李升妮,　洪战英,　柴逸峰(第二军医大学药学院, 上海 200433)

β-受体阻滞剂药物,又名洛尔类药物,具有降低血压、减慢心率、改善心肌缺血和心功能的作用,被用于治疗高血压、心绞痛和心律失常等疾病[1]。β-受体阻滞剂根据其作用特点可分为三类[2-4]:第一类为非选择性阻断β1和β2受体,常用药物为普萘洛尔;第二类为选择性阻断β1受体,常用药物为美托洛尔;第三类为非选择性阻断β1和β2受体,同时阻断α1受体,具有外周扩血管的作用,常用药物为阿罗洛尔和卡维地洛，以上4种典型代表性药物的结构式见图1。这类药物结构中含有手性中心,临床上多以消旋体形式给药,但其对映体的药理、药代和毒理作用具有显著性差异,左旋体的药理活性明显高于右旋体[5,6]。普萘洛尔左旋体的β受体阻断作用比右旋体强约100倍[7];美托洛尔左旋体的β受体阻断作用是右旋体的33倍[8];S-卡维地洛的β受体阻断活性大约是R-卡维地洛的200倍[9];S-阿罗洛尔的药理活性比R-阿罗洛尔强[10]。因此,建立β-受体阻滞剂对映体手性拆分方法,对该类药物的质量控制及其药理、药代和毒理作用研究具有重要意义。

图 1　普萘洛尔、美托洛尔、卡维地洛和阿罗洛尔的化学结构式Fig. 1　Chemical structures of propanolol, metoprolol, carvedilol and arotinolol * Chiral center.

手性药物拆分常用的方法包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、超临界流体色谱法(SFC)和薄层色谱法(TLC)等[11]。目前主要采用手性固定相法[12-18]、手性流动相添加法[19,20]和手性试剂衍生化法[21]对β-受体阻滞剂对映体进行拆分,尤其以手性固定相法的应用居多,测定对象多为普萘洛尔和美托洛尔等,鲜见对阿罗洛尔拆分的研究。近年来,HPLC-MS/MS技术集合了高效液相色谱的高分离能力和串联质谱高选择性、高灵敏度的特点,成为手性药物分析研究的有效手段之一。直链淀粉-三(3,5-二甲苯氨基甲酸酯)手性固定相(Chiralpak AD-H)具有较高的对映体选择性,且负载量大,在手性拆分中的应用较为广泛[15,22]。目前尚未见以Chiralpak AD-H为手性柱的HPLC-MS/MS方法同时拆分多种β-受体阻滞剂对映体的文献报道。

本文应用HPLC-MS/MS分析技术,在正相洗脱方式下使用Chiralpak AD-H手性固定相对普萘洛尔、美托洛尔、阿罗洛尔和卡维地洛4种β-受体阻滞剂对映体进行拆分。考察流动相中改性剂和添加剂的体积分数、柱温和流速等因素对保留时间(t)、选择因子(α)和分离度(R)的影响,同时优化了色谱和质谱条件,并对拆分机理进行了初步探讨。

1　实验部分

1.1　仪器和试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪(含G1312A二元泵、G1322A脱气机和G1316A柱温箱)、 CTC PAL自动进样器(美国Agilent公司); API 4000质谱仪(美国Applied Biosystems公司); CP225D电子天平(德国Sartorius公司)。

对照品:普萘洛尔(纯度99.5%, Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司);盐酸阿罗洛尔(纯度99.5%,日本住友制药株式会社);美托洛尔(纯度98%)、卡维地洛(纯度98%)(加拿大Toronto Research Chemicals公司)。正己烷和乙醇为色谱纯(Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司);二乙胺为色谱纯(上海安谱实验科技股份有限公司);甲醇为色谱纯(德国Merck公司)。

1.2　标准溶液配制

精密称取普萘洛尔、美托洛尔、阿罗洛尔和卡维地洛对照品适量,分别用甲醇溶解,配制成质量浓度为1.00 g/L的标准储备液,于4 ℃保存;使用时取适量药物标准储备液,用甲醇稀释成质量浓度为10 μg/L的单标准溶液;根据实验需要用甲醇配制成合适浓度的混合标准溶液。

1.3　液相色谱条件

色谱柱:Chiralpak AD-H柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,大赛璐药物手性技术(上海)有限公司);预柱:Supelco ColumnSaver在线过滤器(0.5 μm, Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司);柱温:40 ℃;流动相:正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v);等度洗脱;流速:0.550 mL/min;进样量:10 μL (10 μg/L)。

1.4　质谱条件

采用电喷雾离子(ESI)源,多反应监测(MRM)、正离子模式;离子源温度(TEM)500 ℃;离子源喷雾电压(IS)4 500 V;离子源气体1(GS1)压力310.3 kPa,离子源气体2(GS2)压力206.8 kPa;气帘气(CUR)压力137.9 kPa;碰撞气(CAD)8 unit。普萘洛尔、美托洛尔、阿罗洛尔和卡维地洛的其他质谱参数见表1。

表 1　4种β-受体阻滞剂对映体的质谱参数Table 1　MS parameters of the four β-blocker enantiomers

DP: declustering potential; CE: collision energy; EP: entrance potential; CXP: collision cell exit potential.

1.5　对映体拆分的热力学过程

液相色谱手性拆分中,对映体在色谱固定相和流动相之间的分离是其自由能之差ΔΔG0(J/mol)所致,对映体之间的α与其关系如下[23-25]:

lnα=-ΔΔG0/RT=-ΔΔH0/RT+ΔΔS0/R

(1)

其中,T是绝对温度(K), R为气体常数(8.314 J/(mol5K)), ΔΔH0(J/mol)、ΔΔS0(J/(mol5K))分别为被分离组分在固定相和流动相间分配的焓变之差和熵变之差。本研究根据优化的色谱条件,测定各对映体的保留因子(k)和α,根据公式(1),对lnα～1/T作图,计算热力学参数,初步探讨β-受体阻滞剂对映体拆分的原理。

2　结果与讨论

2.1　固定相的选择

本研究比较了大赛璐药物手性技术(上海)有限公司的Chiralpak AD-H色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Chiralcel OD-H色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,固定相为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))和Sigma Aldrich(上海)贸易有限公司的CYCLOBOND I 2000SP手性柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,固定相为S-羟丙基醚衍生化的β-环糊精)对普萘洛尔、美托洛尔、阿罗洛尔和卡维地洛对映体的拆分效果。结果表明,Chiralcel OD-H色谱柱不能拆分阿罗洛尔和卡维地洛对映体;CYCLOBOND I 2000SP手性柱无法拆分4种药物对映体;Chiralpak AD-H色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)能对4种药物对映体实现拆分。因此选择Chiralpak AD-H色谱柱进行后续实验条件的优化。

2.2　流动相中有机相改性剂体积分数的选择

醇类作为有机改性剂可使对映体与固定相上的氨基甲酸酯基之间形成氢键,不同结构的醇类会使固定相形成不同手性空穴的空间环境,使对映体分子与固定相中的苯基氨基甲酸酯之间的互相作用发生变化,从而影响手性药物的分离[26]。

本研究以正己烷为流动相主体,乙醇为有机改性剂,在柱温40 ℃、流速0.400 mL/min、流动相中添加0.02%(v/v)二乙胺的色谱条件下,考察在不同体积分数的乙醇条件下普萘洛尔、美托洛尔、阿罗洛尔和卡维地洛对映体的保留时间、选择因子和分离度(见表2)。随着乙醇体积分数的降低,普萘洛尔、美托洛尔、阿罗洛尔和卡维地洛的保留时间均增加,分离度也增加,但选择因子变化不大。这可能是因为流动相中极性成分与固定相形成氢键,抑制了对映体与固定相之间的氢键作用,因此降低乙醇的体积分数有利于对映体的分离。但当乙醇体积分数较低时,会大大增加各药物的保留时间,同时扩散作用也使得峰形变宽。当乙醇的体积分数为80%时,各化合物保留时间最短,峰形最好,且分离度均良好。

表 2　乙醇体积分数对4种β-受体阻滞剂对映体分离的影响Table 2　Effect of volume fraction of ethanol on the enantioseparation of the four β-blocker enantiomers

t1,t2: retention times of enantiomers;α: selective factor;R: resolution.

2.3　流动相中二乙胺的体积分数对拆分的影响

本研究中4种β-受体阻滞剂药物均为弱碱性药物,在流动相中添加二乙胺可抑制其离子化;二乙胺还能与手性柱上残留的硅羟基结合,增强手性识别能力[27]。当流动相不添加二乙胺时,各药物对映体的分离度均不佳。在柱温40 ℃、流速0.550 mL/min、流动相正己烷-乙醇(20∶80, v/v)的色谱条件下,考察流动相中添加不同体积分数(0.01%～0.05%)的二乙胺对分离的影响(见图2)。结果发现,4种药物对映体分离度随二乙胺体积分数的增大而增加。考虑到二乙胺的体积分数对4种药物对映体保留时间和选择因子的影响不大，以及二乙胺对质谱响应的影响,最终选择正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)为流动相。

图 2　流动相中二乙胺的体积分数对4种β-受体阻滞剂对映体分离度的影响Fig. 2　Effect of volume fraction of diethylamine in mobile phases on the resolution of the four β-blocker enantiomers

2.4　流速对拆分的影响

本研究在柱温40 ℃、流动相正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)的色谱条件下,考察了流速对4种β-受体阻滞剂对映体分离效果的影响。当流速从0.550 mL/min降至0.300 mL/min时,分离度和保留时间均增加,但低流速会因为分子扩散和传质阻力导致目标物色谱峰展宽。当流速为0.550 mL/min时,各化合物出峰时间短,峰形好,且对映体分离度均良好,故本实验选择0.550 mL/min的流速进行分离。

2.5　柱温对拆分的影响

柱温是HPLC手性分离的重要影响因素,柱温的改变会影响对映体的保留时间、选择因子、分离度和对映体在固定相上吸附、解出的速率,甚至可能导致手性固定相结构发生变化,影响溶质与固定相间的作用,使对映体洗脱顺序反转[28]。

图 3　柱温对4种β-受体阻滞剂对映体(a)保留时间和(b)分离度的影响Fig. 3　Effect of column temperature on the (a) retention time and (b) resolution of the four β-blocker enantiomers

本研究在流速为0.550 mL/min、流动相为正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)的色谱条件下,考察了柱温为25、35、40和45 ℃时4种β-受体阻滞剂对映体的t1和R的变化情况(见图3)。当柱温从25 ℃升高至40 ℃时,各药物的t1缩短,R下降。因为柱温升高使得溶质在固定相和流动相中传质速度变快,从而改变了溶质与固定相间的手性作用力。当柱温为45 ℃时,目标物的t1增长,色谱峰形变差,R增加,这可能是由于柱温升高,手性固定相的构型改变,导致保留机制或对映体与固定相之间的手性识别作用发生了改变。当柱温为40 ℃时,卡维地洛的t1显著缩短,其余对映体保留时间无明显变化,且各对映体能实现基线分离,综合保留时间和色谱峰形这两个因素,为了实现快速分离的目的,最终选择柱温为40 ℃。

2.6　分离度和重复性

综合考虑分析时间和分离效果等因素,确定同时拆分普萘洛尔、美托洛尔、阿罗洛尔和卡维地洛对映体的最佳实验条件,流动相为正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)、流速为0.550 mL/min、柱温为40 ℃。在此条件下连续进样10次,4种对映体出峰时间和峰面积的RSD均小于10%。各化合物的保留时间、选择因子和分离度见表3,典型色谱图见图4。该方法能同时拆分4种洛尔类对映体,简单、快速,且重复性好。

表34种β-受体阻滞剂对映体的保留时间、选择因子和分离度

Table3Retention times, selective factors and resolutions of the fourβ-blocker enantiomers

Compoundt1/mint2/minαRPropanolol6．717．491．121．37Metoprolol7．168．081．141．80Arotinolol7．889．301．192．09Carvedilol17．1123．721．404．70

图 4　4种β-受体阻滞剂对映体的典型手性拆分色谱图Fig. 4　Typical enantioseparation chromatograms of the four β-blocker enantiomers

2.7　对映体拆分机理的探讨

2.7.1对映体拆分的热力学参数

本实验以正己烷-乙醇-二乙胺(20∶80∶0.03, v/v/v)为流动相,在25～40 ℃条件下,测定了各对映体的k和α,再根据公式(1),对lnα～1/T作图,计算了相应的热力学参数,结果见表4。

表 4　4种β-受体阻滞剂对映体的热力学参数Table 4　Thermodynamic parameters of the four β-blocker enantiomers

r2: correlation coefficient; ΔΔG0, ΔΔH0, ΔΔS0: the differences of Gibbs free energy change, enthalpy change, entropy change between stationary phase and mobile phase, respectively;T: thermodynamic temperature, K.

从表4可以看出,4种β-受体阻滞剂对映体在相应温度区域内呈线性关系,说明在本实验的范围内焓变之差和熵变之差为定值,对映体在该手性柱上的选择机制不变;热力学参数中,ΔΔH0表示两对映体与固定相的作用强度之差,ΔΔS0表示自由度变化之差,也反映两个对映体与手性选择剂作用过程构象匹配性的差别程度。若ΔΔH0和ΔΔS0均为负值,说明手性拆分为焓驱动,出峰较晚的异构体较出峰较早的异构体与固定相间的相互作用力更强,且与固定相形成络合物后分子总体变得更有序,温度升高选择因子下降[21]。由表4可知,4种β-受体阻滞剂对映体的ΔΔH0和ΔΔS0均为负值,说明它们的手性拆分均为焓驱动过程;4种药物对映体分离过程的ΔΔG0均为负值,且依次按卡维地洛、阿罗洛尔、美托洛尔、普萘洛尔的顺序增大,这与它们在Chiralpak AD-H色谱柱上的分离度大小顺序一致,即卡维地洛分离度最大,而普萘洛尔分离度最小。

2.7.2Chiralpak AD-H手性固定相的拆分作用

多糖衍生物类手性固定相的拆分机理较为复杂,目前尚不完全明确。多数研究认为在直链淀粉分子中,极性的氨基甲酸酯基团和3,5-二甲基苯基围绕主链形成一个螺旋沟槽,样品分子通过调节构象进入槽内,通过3种作用与固定相形成缔合物:一是化合物结构上的羰基与手性固定相上氨基甲酸酯基上的亚氨基之间的氢键作用,或化合物的亚氨基、羟基等与手性固定相上羰基之间的氢键作用;二是化合物结构上的羰基与手性固定相上氨基甲酸酯基残基上的羰基之间的偶极-偶极作用;三是化合物结构上的苯环与手性固定相上的苯环之间的π-π作用。对映体通过与固定相之间作用形成缔合物的稳定性差异来实现拆分;拥有芳香基团的化合物由于可将其芳香基团插入手性固定相空穴中,形成稳定的非对映异构体缔合物而实现拆分[29-31]。

在本研究中4种β-受体阻滞剂化合物具有相同的手性中心,手性碳原子附近的羰基、羟基和亚氨基都可与手性固定相上氨基甲酸酯基上的亚氨基或羰基相互作用。研究结果显示,普萘洛尔的保留最弱,可能是因其结构上有一个萘环,空间位阻较大,削弱了其与手性固定相间的作用;卡维地洛的保留最强,可能是因其结构中多个芳香基团进入手性固定相孔穴中,形成了稳定的缔合物,从而保留增强。美托洛尔和阿罗洛尔分子中也含有多个可与手性固定相发生氢键作用、偶极-偶极作用和π-π作用的基团,因此也可在Chiralpak AD-H色谱柱上实现手性拆分。

3　结论

本研究首次应用直链淀粉衍生物型手性固定相,在正相色谱条件下,系统地考察了流动相组成、流速和柱温等因素对普萘洛尔、美托洛尔、阿罗洛尔和卡维地洛4种对映体分离的影响,建立了能同时拆分4种β-受体阻滞剂对映体的HPLC-MS/MS手性定量分析方法,并从热力学研究及对映体结构分析的角度对拆分机理进行探讨。该方法简便，重复性好,具有快速高效拆分的优势,尤其是成功拆分了阿罗洛尔对映体,为β-受体阻滞剂对映体的质量控制和生物样品分析研究提供了技术支持。

参考文献:

[1]Li L D. Internal Medicine of China, 2008, 3(2): 259

李立定. 内科, 2008, 3(2): 259

[2]Zhai M, Yu C A, Wang M, et al. Journal of Pharmaceutical Research, 2014, 33(6): 357

翟民, 于长安, 王孟, 等. 药学研究, 2014, 33(6): 357

[3]Wang X Y, Wan X L, Guo X Y, et al. Journal of Xi’an Jiaotong University (Medical Sciences), 2015, 36(6): 730

王晓艳, 万晓龙, 郭晓燕, 等. 西安交通大学学报(医学版), 2015, 36(6): 730

[4]Liu L. Journal of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, 2012, 34(6): 241

刘莉. 贵阳中医学院学报, 2012, 34(6): 241

[5]Ali I, Gaitonde V D, Aboul-Enein H Y, et al. Talanta, 2009, 78(2): 458

[6]Agrawal Y K, Patel R N. J Chromatogr B, 2005, 820(1): 23

[7]Zhang J H, Wang R, Xie H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2011, 29(1): 26

张娟红, 王荣, 谢华, 等. 色谱, 2011, 29(1): 26

[8]Liu G F, Zhen L M, Huang L J. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2010, 30(12): 2263

刘高峰, 甄立棉, 黄丽军. 药物分析杂志, 2010, 30(12): 2263

[9]Chen Z Y, Yao T W, Zeng S. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2008, 36(6): 865

陈仲益, 姚彤炜, 曾苏. 分析化学, 2008, 36(6): 865

[10]Qian Z Y, Xu Y H, Zheng L Y, et al. J Pharm Biomed Anal, 2015, 102: 299

[11]Yang M, Zhong W Y, Hou W. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2014, 38(3): 209

杨沐, 钟文英, 侯雯. 药学进展, 2014, 38(3): 209

[12]Morante-Zarcero S, Sierra I. J Pharm Biomed Anal, 2012, 62: 33

[13]Zhou R D, Li L S, Cheng B P, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(7): 1002

周仁丹, 李来生, 程彪平, 等. 分析化学, 2014, 42(7): 1002

[14]Cheng B P, Li L S, Zhou R D, et al. Journal of Nanchang University (Natural Science), 2017, 41(1): 77

程彪平, 李来生, 周仁丹, 等. 南昌大学学报(理科版), 2017, 41(1): 77

[15]Qiu G B, Zheng L Y, Lü Q Z, et al. Pharmaceutical Care and Research, 2015, 15(5): 351

裘戈彬, 郑乐艺, 吕权真, 等. 药学服务与研究, 2015, 15(5): 351

[16]Ma H P, Li L S, Chen H M, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2010, 38(2): 158

马海萍, 李来生, 陈会明, 等. 分析化学, 2010, 38(2): 158

[17]Huang H, Jin J Y, Li Y Z. Chinese Journal of Chromatography, 2009, 27(4): 467

黄虎, 金京玉, 李元宰. 色谱, 2009, 27(4): 467

[18]Li F, Li J Y, Zhang H Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2008, 26(6): 766

李芳, 李佳杨, 张华燕, 等. 色谱, 2008, 26(6): 766

[19]Wang Z K, Zhao L S, Cui Z, et al. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2015, 32(12): 962

王兆昆, 赵龙山, 崔智, 等. 沈阳药科大学学报, 2015, 32(12): 962

[20]Yang J, Wang L J, Guo Q L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30(3): 280

杨娟, 王利娟, 郭巧玲, 等. 色谱, 2012, 30(3): 280

[21]He Y, Chai X J, Zeng S. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2010, 19(2): 104

[22]Wang L L, Xu X J, Chen G Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2010, 28(3): 305

王丽莉, 徐小静, 陈贵阳, 等. 色谱, 2010, 28(3): 305

[23]Luo A, Wan Q, Fan H J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(9): 1013

罗安, 万强, 范华均, 等. 色谱, 2014, 32(9): 1013

[24]Weng W, Yao B X, Chen X Q, et al. Progress in Chemistry, 2006, 18(7/8): 1056

翁文, 姚碧霞, 陈秀琴, 等. 化学进展, 2006, 18(7/8): 1056

[25]Gao J, Qu H, Zhang C T, et al. Chirality, 2017, 29: 19

[26]Zeng S, Wang S H, Yang B. Chiral Pharmacology and Chiral Drug Analysis. Beijing: China Science Press, 2009

曾苏, 王胜浩, 杨波. 手性药理学与手性药物分析, 北京: 科学出版社, 2009

[27]Wang L P, Fan H J, Wu K H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30(12): 1265

王李平, 范华均, 巫坤宏, 等. 色谱, 2012, 30(12): 1265

[28]Persson B A, Andersson S. J Chromatogr A, 2001, 906(1/2): 195

[29]Wang M. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(2): 198

王敏. 色谱, 2014, 32(2): 198

[30]Yang L M, Xie Y F, Gu Z H, et al. Chirality, 2011, 23(8): 581

[31]Cheng B, Xie Y F, Hu Y M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(6): 647

成斌, 谢一凡, 胡优敏, 等. 色谱, 2015, 33(6): 647

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