高静水压下益气活血汤通过p38MAPK信号通路对兔椎体终板软骨细胞的调控作用

柳根哲,孙　旗，陈　江,赵丁岩,祝永刚

(1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.北京中医药大学第一临床医学院，北京 100700)

椎间盘退变性疾病是严重危害人类健康的多因素、复杂性疾病，其中终板软骨钙化退变参与了椎间盘的退变过程[1]。终板软骨细胞在机械性因素和生物性因素的共同作用下引发相关基因表达变化，诱导终板软骨细胞凋亡，打破细胞外基质合成和降解平衡，终板软骨作为椎间盘营养通道的功能衰减，进而引发椎间盘退变[2]。目前研究发现p38MAPK信号通路广泛参与细胞凋亡、增殖、分化以及炎症反应等生理病理过程[3]，据此推测p38MAPK信号通路可能参与终板软骨钙化退变的过程。益气活血汤具有消补并用、益气活血的功效，能有效减缓腰椎间盘退变，但目前尚未完全探明其确切作用机制。本课题组前期研究发现，在静水压作用下兔椎体终板软骨细胞基因表达呈现“负荷-时间”依赖关系，长时间高压作用可破坏细胞基质动态平衡，推测其可能与细胞内信号系统在细胞水平上负反馈机制的钝化相关，为进一步探索修复椎体终板软骨、预防椎间盘退变提供了新思路[4]。本研究拟通过观察益气活血汤含药血清对持续高静水压下兔终板软骨细胞p38MAPK信号通路的调控作用，探讨益气活血汤治疗椎间盘退行性病变可能的作用机制，为椎间盘退变性疾病的治疗提供新的切入点。

1　实验资料

1.1实验动物清洁级3月龄新西兰兔20只，雌雄各半，体质量1.5～2.0 kg，用于制备血清；4周龄清洁级新西兰兔6只(北京市动物实验中心)，用于终板软骨细胞体外传代培养的取材。中国中医科学院实验动物中心提供清洁级医学实验动物环境设施。

1.2药物益气活血汤由黄芪、三七、当归、白术、熟地、党参、云苓、白芍、陈皮、川芎、甘草组成，由北京中医医院药剂科提供。

1.3实验试剂及仪器DMEM培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibico公司)；胰蛋白酶、I型胶原酶(Sigma公司)；蛋白抽提试剂、BCA蛋白定量试剂盒(赛诺博)；磷酸化p38兔多抗、p38兔多抗(CST)；山羊抗兔IgG、GAPDH鼠单抗(天德悦)；静水压加载系统(北京世纪森朗实验仪器有限公司)；Fresco低温冷冻离心机、MultiSkan3酶标仪(Thermo)；湿转电泳槽、电泳仪(Cavoy)；水平脱色摇床(其林贝尔)；酸度计 pH211(Hanna)；电动组织匀浆器(Fluka)。

1.4实验方法

1.4.1益气活血汤含药血清的制备将20只清洁级3月龄新西兰兔随机分为含药血清组和空白血清组，每组10只。根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表换算，新西兰兔给药剂量=临床常用量×动物等效剂量系数(按体表面积)×培养基内稀释度[5]。含药血清组给予益气活血汤11.6 g/(kg·d)灌胃，空白血清组给予同体积生理盐水灌胃，上午、下午各1次，2组均连续灌胃7 d，于末次灌胃后2 h腹主动脉采血，静置于4 ℃冰箱4 h后，2 500 r/min离心25 min，分离血清，同组血清混合，于56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤器过滤，分装，-20 ℃保存备用。

1.4.2终板软骨细胞体外培养静水压加载干预模型的建立从3周龄清洁级新西兰兔椎间盘中分离得到终板软骨细胞，进行细胞培养至第3代终板软骨细胞。将体外培养的第3代软骨细胞和培养基装入20 mL塑料注射器中，然后放入体外单层细胞静水压加载系统(具有加压方便、操作安全的特点，其不仅具有普通液态加载装置的优点，还可以在维持细胞加压环境中药物浓度、离子组成、渗透压不变的条件下，根据实验需要自由改变静水压，同时还可以模拟正常人体椎间盘内的低氧及恒温环境，见图1)的压力罐中，根据实验需要施加不同的静水压，维持压力罐温度在37 ℃。

图1　静水压装置示意图及细胞加载方式

1.4.3确定高静水压加载干预下益气活血汤含药血清对终板软骨细胞最佳量效关系将第3代终板软骨细胞随机分为5组：正常组无任何干预；模型组不加益气活血汤含药血清，放入压力罐中，施加1MPa静水压培养24 h；3个含药血清组分别用浓度为0.5，1，2 μg/μL益气活血汤含药血清干预终板软骨细胞，然后放入压力罐中，施加1 MPa静水压培养24 h。每组每个时间段设6个复孔，做好标记及记录，培养24 h后运用MTT法检测各组终板软骨细胞的增殖率，确定在高静水压加载下益气活血汤含药血清干预终板软骨细胞的最佳量效关系。

1.4.4Western Blot法检测终板软骨细胞磷酸化p38、p38蛋白表达水平将第3代软骨细胞按抽签法随机分为空白组、模型组、益气活血汤含药血清组，1 MPa静水压及1 μg/μL益气活血汤含药血清干预24 h后，使用预冷RIPA蛋白抽提试剂提取终板软骨细胞中总蛋白，加入蛋白酶抑制剂，BCA 法测定蛋白含量，RIPA调整蛋白浓度，Western Blot 法检测蛋白表达量，待检测蛋白样品上样量10 μg/孔，设置合适的电泳条件，湿转法转膜，转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。将膜完全浸没3% BSA-TBST中室温轻摇30 min，加入一抗：磷酸化p38 1∶4 000， p38 1∶1 000。4 ℃过夜，第2天TBST洗膜5次，每次3 min，结合二抗山羊抗兔IgG(H+L)HRP，1∶20 000，室温轻摇40 min， TBST洗膜6次，每次3 min，ECL化学发光检测，显影2 min后定影。内参蛋白GAPDH检测：一抗选用GAPDH鼠单抗，二抗为山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP，1∶10 000，实验步骤同磷酸化p38、p38蛋白表达检测方法。

2　结　　果

2.1终板软骨细胞的形态及鉴定原代软骨终板细胞呈球形悬浮状态，具有强折光性，培养24 h后逐渐贴壁伸展，细胞形态以三角形、多角形为主，核为圆形或椭圆形，胞浆丰富，内含分泌颗粒。在37 ℃ 5%CO2培养条件下培养1周后，在倒置相差显微镜下观察到细胞间开始有突起连接，周围有基质样物质沉积，细胞呈单层生长状态，逐渐铺满培养瓶，2周后终板软骨细胞基本铺满培养瓶。第3代软骨终板细胞增殖速度较快，细胞生长成熟，形状开始出现长梭形，故选用第3代终板软骨细胞进行研究。 甲苯胺蓝染色可以观察到正常终板软骨细胞胞浆呈蓝色，可见1～2个核仁，呈蓝紫色。正常终板软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性反应，细胞胞浆内有棕黄色颗粒，胞核基本无着色。见图2及图3。

图2　倒置相差显微镜下终板软骨细胞形态

图3　第3代终板软骨细胞甲苯胺蓝染色及免疫组化染色

2.2最佳益气活血汤含药血清干预浓度正常组MTT法测定细胞增殖率(OD490)为0.472±0.023，模型组为0.218±0.023，0.5 μg/μL含药血清组为0.338±0.019，1 μg/μL含药血清组为0.458±0.017，2 μg/μL含药血清组为0.357±0.024。模型组终板软骨细胞增殖率明显低于正常组(P<0.05)；0.5，1，2 μg/μL含药血清在静水压干预下均能促进软骨细胞增殖，其中1 μg/μL含药血清组终板软骨细胞增殖率明显高于模型组(P<0.05)，故选择以1 μg/μL浓度的益气活血汤含药血清作为后续实验的最佳含药血清干预浓度。

2.3终板软骨细胞中磷酸化p38、p38蛋白表达情况各组均可见磷酸化p38、p38蛋白的表达，各组p38蛋白表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05)。正常组磷酸化p38微弱表达，模型组磷酸化p38蛋白表达量明显高于正常组(P<0.05)，而含药血清组磷酸化p38蛋白表达量明显低于模型组(P<0.05)。见图4及表1。

3　讨　　论

椎间盘退变是人体自然衰老的过程之一。近年研究证实，终板软骨钙化退变所致的营养代谢及物质转运功能的衰减是椎间盘退变的始动因素和关键环节[6]，终板软骨是供应椎间盘营养的主要通道，一旦终板软骨出现钙化退变，椎间盘的营养供应就会出现障碍，从而导致椎间盘退变。终板软骨细胞是终板软骨内唯一细胞成分，其功能减退可引起终板软骨的功能障碍[7-8]。本课题组前期研究证实静水压大小及作用时间可以显著影响终板软骨细胞基因的表达，椎体终板软骨细胞在高静水压(1 MPa)下培养24 h后出现细胞基质合成基因和抗分解代谢基因表达下降，同时炎症反应相关基因及细胞基质分解代谢基因表达提高，提示高压持久作用对基质动态平衡产生不利影响，细胞外基质代谢紊乱可引起椎体终板功能受损，从而诱发椎间盘退行性病变[4]。p38MAPK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)介导的信号转导通路的重要分支，在细胞凋亡、炎症反应、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中发挥着重要的调节作用[9]。

图4　各组终板软骨细胞中磷酸化p38、p38蛋白表达情况

表1　各组终板软骨细胞中磷酸化p38、p38蛋白表达量比较

注：①与模型组比较，P<0.05。

祖国传统医学认为椎间盘退变病机为体姿失当，气血失调，日久累积致气虚血瘀，治当以调理气血、益气活血为法。益气活血方消补并用，补气而不壅滞，攻伐而不伤正，破中有补，补中有行，可以显著抑制炎症反应，减少炎性因子的生成，有效抑制椎间盘细胞凋亡，促进椎间盘细胞增殖，进而延缓椎间盘的退变[10]。本研究通过体外实验观察了益气活血汤含药血清对持续性高静水压干预的终板软骨细胞的作用，结果发现终板软骨细胞在单纯高静水压作用24 h后，细胞增殖能力受到明显抑制，细胞凋亡数量增加；同时各浓度益气活血汤含药血清组在持续高静水压刺激24 h后均有促进终板软骨细胞增殖的作用，其中以1 μg/μL浓度的益气活血汤含药血清促细胞增殖作用最明显。证实益气活血汤含药血清对高静水压诱导的终板软骨细胞凋亡具有保护作用，可明显促进终板软骨细胞增殖。

既往研究发现，在机械应力、渗透压变化、氧化反应等因素刺激下即可引起p38MAPK磷酸化，磷酸化的p38MAPK随即转位到细胞核，激活转录因子，启动相关基因的表达，进而影响细胞因子生成，参与细胞增殖、调控细胞凋亡等生理病理过程，与椎间盘退行性病变的病理过程密切相关[11]。Ariga等[12]研究发现随着外在压力的增高，体外培养的终板软骨细胞增殖能力下降，细胞凋亡增加，p38MAPK信号通路可能发挥着重要的调节作用。本研究结果显示，正常组磷酸化p38表达微弱，高静水压刺激24 h后，磷酸化p38蛋白表达显著升高，而益气活血汤含药血清能显著下调磷酸化p38表达，因此推测益气活血汤可能通过调控p38MAPK信号通路的激活发挥保护终板软骨细胞的作用。

综上所述，持续高静水压刺激可以显著降低终板软骨细胞增殖率，促进磷酸化p38蛋白表达，而益气活血含药血清能显著抑制上述作用，推测益气活血汤可能通过介导p38MAPK信号通路的激活，参与了持续高静水压诱导的兔终板软骨细胞凋亡的信号转导，可能有助于阻止终板软骨的退变，为揭示其治疗椎间盘退变性疾病的作用机制了提供新的研究思路，对指导椎间盘退变性疾病的防治具有重要意义。但由于体外实验环境单一，不能够完全模拟体内复杂的细胞因子表达变化和细胞因子具体的信号传导通路，故还需构建相关动物模型进行体内实验；另外，p38MAPK信号通路包括上游信号因子及下游效应因子，其具体所涉及的细胞因子还需要进一步研究。

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