液相色谱-串联质谱快速检测干血点样品中尿酸

李广林，韩吉春，王小臣，赵雅君，骆亦奇

(杭州量康医学检验所，浙江 杭州　310052)

尿酸(uric acid, UA)是人体内嘌呤代谢的最终产物，主要经肾脏排出。血液UA水平是临床诊断痛风、肾结石和肾衰竭的重要指标之一。研究表明[1-10]，高尿酸血症是脑白质病变、糖尿病、高血压、冠心病及代谢综合征的风险因子之一，低尿酸血症则可能增加心血管、骨损伤及胆囊疾病的风险。因此，准确、快速地检测血液UA水平可以为某些疾病的预防、诊断及治疗提供依据。

目前， UA的检测方法包括磷钨酸还原法、酶法[11]、高效液相色谱法(HPLC)[12-13]、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)[14]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[15-16]以及同位素稀释质谱法(IDMS)[17]等。临床上最常用的是酶法，该方法操作简便，但仅适用于血清样品；HPLC法受生物基质影响较大，特异性较差；GC/MS法在一定程度上解决了特异性问题，但样品需衍生化，前处理较繁琐。LC-MS/MS法具有样品适用性广、特异性好、灵敏度高、检测速度快等特点，但样品的前处理过程复杂、耗时较长，且人工操作引入的误差容易导致检测方法不稳定。而样品前处理的自动化能够较好地解决人为因素造成的误差，同时可以进行批量处理，提高工作效率。

干血点(dried blood spot, DBS)是将抗凝全血收集在特定的滤纸卡片上，晾干后通过一定处理即可进行检测的一种血液样品形态。早在20世纪60年代，DBS样品就已被用于苯丙酮尿症的新生儿筛查中[18]。随着色谱、质谱技术及健康产业的蓬勃发展，DBS样品在各类疾病的诊断及筛查中的应用价值日益凸显。与传统的临床液体血样相比，DBS样品具有如下优势：首先，样品采集简单方便、成本低，用户个人可自助完成采样，无需具有采血资质的专业人士操作，无需离心机等专业设备；其次，采样不受地域限制，自助采完血样并晾干，然后通过邮寄等方式送至实验室即可进行检测，适合慢性疾病的长期监控；再次，DBS样品稳定性好，可承受较长时间的运输和储存，且运输过程不需要特殊的冷链设施；最后，DBS样品交叉感染风险小，基本无生物危害性，在运输、保存和检测操作中，安全性强。

本研究拟建立一种基于LC-MS/MS与高通量自动移液平台联用检测DBS中UA的方法，使样品前处理过程实现自动化，并采用LC-MS/MS多反应监测(MRM)模式检测分析。希望为人体内血液UA水平的大规模筛查提供方法参考。

1　实验部分

1.1　仪器和材料

Agilent 1290-6495液相色谱-串联质谱仪，Bravo自动液体操作平台，在线过滤器：美国Agilent公司产品；色谱柱：Luna CN 柱(100 mm×2 mm×3 μm)，美国Phenomenex公司产品；Hitachi7180全自动生化仪：日本Hitachi公司产品；分析天平：德国Sartorius公司产品；3 mm打孔器及打孔垫：美国Ted Pella公司产品；超纯水仪：德国EDM Millipore公司产品；96孔透明深孔板，8道深孔板：美国Axygen公司产品；96孔PCR进样板：美国Bio-Rad公司产品；Whatman 903 CF12滤纸：美国GE公司产品。

UA标准品：纯度≥98%，上海安谱公司产品；UA稳定同位素内标UA-1,3-15N2：纯度≥98%，美国CIL公司产品；Tris-HCl晶体：美国Sigma-Aldrich公司产品；乙腈，甲酸：均为质谱级，上海安谱公司产品；盐酸：质谱级，西班牙Scharlau公司产品；抗凝全血样品及血清样品：由江山人民医院提供。

1.2　标准溶液的配制

用40.0 mmol/L NaOH溶液溶解，配制25.0 mmol/L UA母液。用0.2 mol/L Tris缓冲溶液溶解，配制5.0 mmol/L UA-1,3-15N2内标母液，并分装。将内标母液用0.2 mol/L Tris溶液稀释为100.0 μmol/L内标工作液，并分装。将配制的母液与内标标准溶液于-80 ℃保存，使用时配制所需浓度的标准溶液。

1.3　实验条件

1.3.1色谱条件色谱柱： CN柱(100 mm×2 mm×3 μm)，前端配有在线过滤器；流动相：0.1%甲酸的水溶液-0.1%甲酸的乙腈溶液(95∶5，V/V)，等度洗脱，流速0.3 mL/min；进样体积1.0 μL；柱温25 ℃。

1.3.2质谱条件采用电喷雾离子源正离子检测模式；多反应监测模式；干燥气温度150 ℃，流速16 L/min；鞘气温度350 ℃，流速11 L/min；毛细管电压3 000 V；喷嘴电压500 V；离子漏斗高、低射频电压分别为150和100 V。UA和UA-1,3-15N2准分子离子峰分别为m/z169.0和m/z171.1，通过进一步二级质谱碎裂，最终确定UA的特征离子对分别为m/z169.0>141.1和m/z169.0>126.1，其中m/z169.0>141.1为定量离子对，相应UA内标UA-1,3-15N2的定量离子对为m/z171.1>143.0。UA和UA-1,3-15N2主要质谱采集参数列于表1。

1.4　DBS样品的制备及前处理

将20.0 μL抗凝全血滴于滤纸片上，室温下晾2 h后，于-80 ℃保存，待测。用打孔器取2片制备的直径3.0 mm的DBS样品于96孔深孔板中，加入40.0 μL 100 μmol/L UA-1, 3-15N2内标工作液，室温下振荡5 min，然后加入400 μL沉淀剂(含体积分数为0.1%甲酸、0.05%三氟乙酸的乙腈溶液)，振荡5 min，以3 500 r/min离心10 min，吸取70.0 μL上清液至96孔PCR进样板中，进行LC-MS/MS分析。整个前处理过程中，除打孔外，其余步骤均在Bravo自动液体操作平台上进行。

表1　UA和UA-1,3-15N2质谱采集参数Table 1　Mass parameters of UA and UA-1,3-15N2

2　结果与讨论

2.1　方法学验证

图1　UA定量检测标准曲线Fig.1　Standard curve of UA quantitation

2.1.1标准曲线为准确检测DBS样品中UA含量，采用基质添加方法制备标准曲线。取9等份抗凝全血，分别添加不同浓度的UA标准品至终浓度为0.0、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500和1 000 μmol/L。然后按照1.4节方法制备DBS，并进行前处理，各浓度重复测定6次。以扣除本底抗凝全血中UA和UA-1,3-15N2峰面积比值为y，以添加的UA标准品浓度为x(μmol/L)，绘制标准曲线，权重取1/x，示于图1。结果表明，UA检测结果与UA添加浓度在7.8～1 000 μmol/L范围内的线性关系良好，线性方程为y=0.001 36x+0.000 25，线性相关系数R2=0.999。人血清中UA浓度参考范围为90～420 μmol/L[19]，该线性范围可以满足DBS中UA的检测。

2.1.2检出限与定量限抗凝全血中含有内源性UA，因此本研究以UA稳定同位素内标UA-1,3-15N2评估检出限(LOD)和定量限(LOQ)。在抗凝全血中添加不同浓度的UA-1,3-15N2，混匀后按照1.4节方法制备DBS样品。前处理过程在1.4节基础上有所改变，将原来添加的40.0 μL内标工作液改为40.0 μL 0.2 mol/L Tris溶液。前处理完成后，按1.3节方法分析。结果表明，DBS样品中UA检出限为3.1 μmol/L(S/N=3)，定量限为12.5 μmol/L(S/N=10)。在浓度分别为3.1、12.5、200 μmol/L时，UA-1,3-15N2的MRM图示于图2。

2.1.3精密度与回收率取抗凝全血，添加不同浓度的UA标准品至终浓度分别为低(50.0 μmol/L)、中(300 μmol/L)、高(700 μmol/L)，按照1.4节方法进行DBS样品制备和前处理，按照1.3节方法分析样品。日内精密度实验中，各添加水平样品重复测定10次。日间精密度实验中，各添加水平样品连续测定5天，每天重复测定5次。将日间精密度实验中每日的实验结果取平均值，得到当天的UA检测值，再将5天的UA检测值取平均值，得到平均UA检测值和平均回收率。其中，添加样品UA检测值为实测UA数值减去本底UA数值。各添加水平样品在5天实验中的平均回收率为95%～101%。结果表明，该方法的精密度与准确度良好，具体结果列于表2。

2.1.4样品稳定性DBS样品在不同温度下随时间变化的稳定性：取3份抗凝全血，添加不同浓度的标准品至终浓度分别为低(50.0 μmol/L)、中(300 μmol/L)、高(700 μmol/L)，按照1.4节方法制备DBS，将3种浓度样品均分3份并分3组，每组包含低、中、高样品。将3组样品分别储存于37 ℃、室温、-20 ℃环境下，于放置的第1、2、3、4、5、7、10、15、20、30天进行样品前处理并检测。结果表明，在-20 ℃环境下，30天内的RSD为5.0%～9.0%，样品稳定性良好；在37 ℃和室温环境下，样品在7天内的检测结果总体RSD小于15%。

图2　浓度为3.1(a)，12.5(b)和200 μmol/L(c)时，UA-1,3-15N2的MRM图Fig.2　MRM chromatograms of UA-1,3-15N2 with 3.1 (a), 12.5 (b) and 200 μmol/L (c)

尿酸添加浓度SpikedUAlevel/(μmol/L)精密度Precision日内Intra-dayRSD/%日间Inter-dayRSD/%平均尿酸检测值AverageUAlevel/(μmol/L)平均回收率Averagerecovery/%空白3.48.7273±9—50.0121451±6101±123006.35.3285±1895±67004.25.9683±2998±4

DBS样品反复冻融稳定性：按上述方法对样品分组，并进行冻融稳定性实验。样品于-20 ℃放置22 h，室温下放置2 h为一个冻融循环，连续进行5次。结果表明，低、中、高浓度样品反复冻融的RSD分别为5.9%、9.2%、2.0%，冻融稳定性良好。

2.2　实际样品检测

采集204个抗凝全血样品，按1.4节方法制备DBS，LC-MS/MS检测分析UA。同时，采用传统临床诊断中常用的Hitachi 7180全自动生化仪检测204个临床血清样品中的UA。以传统生化法检测血清中UA浓度为x(μmol/L)，以本实验方法检测UA浓度为y(μmol/L)，绘制曲线，示于图3。得到拟合曲线方程y=0.909x+3.345，线性相关系数R2=0.946，说明本实验方法与传统生化法检测UA的相关性良好。

图3　LC-MS/MS检测DBS中UA与传统生化法检测血浆中UA浓度的比较(n=204) Fig.3　Comparison of UA concentrations in the DBS samples determined by LC-MS/MS and in the plasma samples by conventional biochemistry assay (n=204)

3　结论

本研究建立了一种基于液相色谱-串联质谱检测DBS样品中UA的方法，该方法简单方便、生物稳定性好、方便储存和运输。前处理过程使用Bravo自动化液体处理平台及高通量的96孔板，降低了人为误差，提高了方法精密度。使用同位素内标避免了基质效应。该方法与传统生化方法的相关性好，适用于有限采血条件下UA的检测及相关疾病的大规模筛查。

参考文献：

[1]KUTZING M K, FIRESTEIN B L. Altered uric acid levels and disease states[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2008, 324(1): 1-7.

[2]de OLIVEIRA E P, BURINI R C. High plasma uric acid concentration: causes and consequences[J]. Diabetology and Metabolic Syndrome, 2012, 4(1): 1-7.

[3]SUN M J, LI B H, LONG C Y, et al. Association between serum uric acid levels and cerebral white matter lesions in Chinese individuals[J]. International Journal of Neuroscience, 2016, 126(12): 1 103-1 111.

[4]DEHGHAN A, van HOEK M, SIJBRANDS E J, et al. High serum uric acid as a novel risk factor for type 2 diabetes[J]. Diabetes Care, 2008, 31(2): 361-362.

[5]BORGHI C, VERARDI F M, PAREO I, et al. Hyperuricemia and cardiovascular disease risk[J]. Expert Review of Cardiovascular Therapy, 2014, 12(10): 1 219-1 225.

[6]DING X H, WANG X N, CAO R H, et al. GW27-e0533 A higher baseline plasma uric acid level is an independent predictor of arterial stiffness: a community-based prospective study[J]. Journal of the American College of Cardiology, 2016, 68(16): C79-C79.

[7]DENOBLE A E, HUFFMAN K M, STABLER T V, et al. Uric acid is a danger signal of increasing risk for osteoarthritis through inflammasome activation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(5): 2 088-2 093.

[8]MENDE C. Management of chronic kidney disease: the relationship between serum uric acid and development of nephropathy[J]. Advances in Therapy, 2015, 32(12): 1 177-1 191.

[9]WANG J Y, CHEN Y L, HSU C H, et al. Predictive value of serum uric acid levels for the diagnosis of metabolic syndrome in adolescents[J]. Journal of Pediatrics, 2012, 161(4): 753-756.

[10] 安映红，翁余海，陈友谊，等. 浙江舟山群岛居民高尿酸血症人群分布及发病率分析[J]. 现代检验医学杂志，2016,31(3):102-104.

AN Yinghong, WENG Yuhai, CHEN Youyi, et al. Population distribution and incidence analyses of hyperuricemia in zhoushan island[J]. Journal of Modern Laboratory Medicine, 2016, 31(3): 102-104(in Chinese).

[11] 张江涛，张传宝，曾洁，等. 血清尿酸13种常规检验系统正确度的评价[J]. 中华检验医学杂志，2015,38(9):609-612.

ZHANG Jiangtao, ZHANG Chuanbao, ZENG Jie, et al. Trueness evaluation of 13 routine measurements for serum uric acid[J]. Chinese Journal of Laboratory Medicine, 2015, 38(9): 609-612(in Chinese).

[12] LI X L, SHI Q, JIN W L, et al. Uric acid quantification in fingernail of gout patients and healthy volunteers using HPLC-UV[J]. Biomedical Chromatography, 2016, 30(8): 1 338-1 342.

[13] 马玉花，黄冬群，张瑞，等. 高效液相色谱法同时测定尿液中4种非蛋白氮的含量[J]. 色谱，2013,31(11):1 102-1 105.

MA Yuhua, HUANG Dongqun, ZHANG Rui, et al. Simultaneous determination of four common nonprotein nitrogen substances in urine by high performance liquid chromatography[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(11): 1 102-1 105(in Chinese).

[14] SUN Y P, CHEN J, QI H Y. Graphitic carbon nitrides modified hollow fiber solid phase microextraction for extraction and determination of uric acid in urine and serum coupled with gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2015, (1 004): 53-59.

[15] LUO X, CAI N F, CHENG Z N. Determination of uric acid in plasma by LC-MS/MS and its application to an efficacy evaluation of recombinant urate oxidase[J]. Analytical Sciences, 2013, 29(7): 709-713.

[16] KWON K, KIM J Y, SUH S, et al. Simultaneous determination of creatinine and uric acid in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with polarity switching electrospray ionization[J]. Forensic Science International, 2012, 221(11 213): 57-64.

[17] DAI X H, FANG X, ZHANG C M, et al. Determination of serum uric acid using high-performance liquid chromatography (HPLC)/isotope dilution mass spectrometry (ID-MS) as a candidate reference method[J]. Journal of Chromatography B, 2007, 857(2): 287-295.

[18] 韩吉春，李广林，王小臣，等. 液相色谱-串联质谱法检测干血点中的同型半胱氨酸[J]. 色谱，2016,34(6):567-571.

HAN Jichun, LI Guanglin, WANG Xiaochen, et al. Determination of homocysteine in dried blood spots using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(6): 567-571(in Chinese).

[19] 从玉隆，王金良，李晓军，等. 实用检验医学[M]. 北京:人民卫生出版社,2013:576-577.

[20] NAGENDRA S, YOGARAJE G C V, KARSHINATH R T. A comparative study of plasma uric acid, erythrocyte uric acid and urine uric acid levels in type 2 diabetic subjects[J]. Merit Research Journal of Medicine and Medical Sciences, 2015, 3(12): 571-574.