CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中的研究进展

王佩 刘文 沈祥陵

（三峡区域植物遗传与种质创新重点实验室（三峡大学） 湖北省三峡特色植物繁育工程技术研究中心 三峡大学生物技术研究中心，宜昌 443002）

丝状真菌通常分为3类，蕈菌、霉菌和酵母菌，它与人类生活息息相关，在工农业生产、医疗实践、环境保护和生物学基本理论研究方面发挥着重要作用。但真菌易感染农作物、动物，甚至包括人类在内的生物体，常导致农作物绝收、人类致命性疾病等问题。因此，国家每年投入数十亿美元来控制农产品中的霉菌毒素。目前，绝大多数真菌的次生代谢物正等待着被发现和鉴定，为此全基因组测序的真菌物种数量正在迅速增加。然而，使用传统的方法研究真菌耗时费力，这是长期以来阻碍真菌实现基因编辑的主要原因。近年来，细菌和古细菌免疫CRISPR/Cas9机制被设计成强大的基因编辑系统，因其使用方便、构建简单、成本低、可以覆盖大多数区域的基因编辑需求，而受到广大研究人员的青睐。但由于某些真菌中极低的同源重组率、某些物种中缺乏质粒体系，以及缺乏用于表达单链RNA（sgRNA）的RNA聚合酶III（RNA Pol III）启动子等原因，使得CRISPR/Cas9体系在丝状真菌中的发展非常缓慢。随后，科研人员将该系统进行了改良并应用于真菌，使得基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统在真菌中的应用也越来越多。

1 CRISPR/Cas9系统概述

1.1 基本结构

CRISPR/Cas系统是古细菌在长期进化过程中与病毒进行斗争形成的免疫工具，而CRISPR/Cas9是其中的一种，一般细菌中都含有1-2 个CRISPR/Cas基因座。典型的CRISPR/Cas系统是由CRISPR簇、Cas蛋白基因以及前导序列（Leader sequence）组成的。其中CRISPR簇由不连续的重复序列（Repeat）、长度相似的间隔序列（Spacers）按一定顺序排列而成，重复序列是指一系列短的高度保守的正向序列，长度约21-47 bp，一般为32 bp［1-2］，且具有回文结构或发夹样二级结构［3］，重复次数可高达250次；间隔序列是指来源于病毒或者其他外源基因的片段，长度约为26-72 bp；Cas基因是一类保守的基因家族，主要编码核酸酶、DNA 解旋酶、聚合酶等与切割、修饰相关的蛋白，一个CRISPR/Cas基因座通常包含4-20个不同的Cas基因，这些基因可以位于CRISPR重复间隔序列的上游或者下游；而Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，具有HNH 和RuvC两个活性位点［4］，可以分别切割与crRNA 互补的DNA 链和非互补链，从而形成DNA双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs），它与folk酶功能相似，但它并不需要形成二聚体来发挥作用；前导序列是指一段富含 A/T 碱基、包含启动子、长度约20-534 bp的序列，通常位于重复间隔序列的5' 端。

1.2 最新分类

大多数古细菌和近一半细菌基因组中都有大量不同的CRISPR/Cas系统。最新 CRISPR/Cas分类方案划定两大类，分别分为3种类型［5］。两大类的CRISPR/Cas系统在效应器模块组成方面有很大不同。第1类系统包括I、III和IV型，存在于细菌和古细菌中，包含4-7个Cas蛋白质亚基组成的效应物复合物，如用于抗病毒防御的CRISPR相关复合物及III型系统的Csm/Cmr复合物。1类效应复合物的大部分亚基，特别是Cas5、Cas6和Cas7都含有RNA结合结构域即RNA识别基序（RRM）。虽然I型和III型效应复合物的单个亚基之间的序列相似性较低，但两者具有显著相似的总体结构，可能起源于共同的祖先，同属于1类系统。第2类CRISPR/Cas系统包括统II型、V型和VI型，几乎只存在于细菌中，效应复合物由单个多结构域蛋白组成。其中Cas9（II型）是2类系统中的典型代表，RNA依赖性内切核酸酶包含两个核酸酶结构域HNH和RuvC。

1.3 作用机制

CRISPR/Cas9介导的适应性免疫可以分为3个步骤：适应、表达和干扰［6］。在第一步适应期间，来自入侵元件的外源DNA片段被处理并作为新的间隔片段并入CRISPR阵列；第二步表达涉及CRISPR阵列的转录，其后将前体转录物加工成成熟的CRISPR RNA（crRNA）。将crRNA与一种或多种Cas9蛋白组装成CRISPR核糖核蛋白（crRNP）复合物；第三步干扰涉及由crRNP复合体内的Cas9核酸酶定向切割同源病毒或质粒。CRISPR/Cas9系统的多面体和模块化结构使其能够在基因编辑中发挥不可替代的作用。

1.4 影响CRISPR/Cas9系统编辑效率的因素

CRISPR/Cas9技术的出现在全球范围内掀起了一场基因编辑技术革命热潮，该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑，包括敲除、插入和修复等。它具有锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALENs）不可比拟的优势。然而研究发现，该技术虽然可以高效快速地进行基因编辑，但脱靶效应和PAM依赖性等严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。

1.4.1 脱靶效应 脱靶效应（Off-target effects）是指种子序列（gRNA）没有与靶点DNA序列相匹配，从而引入非预期基因突变的现象。编辑过程中gRNA与靶点DNA序列碱基错配的出现［7］或gRNA序列中DNA凸起的形成［2］都可以形成gRNA与其他碱基的配对而产生脱靶效应。此外，由于gRNA与目标基因组结合的20 nt序列决定系统的靶向特异性，因此gRNA的长度对脱靶效应也有很大的影响［8］，另有研究显示，脱靶效应还具有细胞特异性［9］。

针对CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，已经有多个实验室进行了研究，研究表明可以从3个方面来降低该技术的脱靶效应。首先就是选择合适的gRNA，gRNA分为种子区和非种子区，真正影响gRNA结合效率的是最接近PAM序列的1-5个碱基，因此在设计gRNA时要选择特异性高的序列，尤其注意靠近PAM序列的5个碱基，与此同时，可以借助一些网络优化工具［10］；第二，可以通过优化含有gRNA的质粒的浓度来降低脱靶效应，因为过高的浓度会增加脱靶的概率，而过低的浓度则会降低正确的敲除效率［11］；第三，可以用失活的Cas9（d Cas9）与 Fok I 核酸内切酶区域结合形成融合蛋白，仅仅两个单体蛋白单体结合时才能发挥切割作用，此方法运用了d Cas9的识别作用和Fok I 核酸内切酶的精准切割作用，可大大降低脱靶效应［12-13］。

1.4.2 PAM依赖性 PAM序列是CRISPR/Cas基因编辑系统可以正确切割靶基因的基本条件，直接决定CRISPR的靶向特异性。该序列约为2-9 bp，位于靶DNA的3'末端。在常用的来自于酿脓链球菌的CRISPR系统中PAM序列为NGG，来自于嗜热链球菌的PAM序列为NGGNG和NNAGAAW；来自脑膜炎双球菌的PAM序列为NNNNGATT［11，14］，它们都具有高度的保守性。如果不存在PAM序列，即使靶序列与gRNA 序列完全匹配，Cas9蛋白也不会对目标序列位点进行切割［15］。PAM序列的依赖性对切割的目标序列造成了一定的限制，且PAM序列的碱基数的多少同样对系统识别的特异性造成影响，越长的PAM序列具有越高的特异性。

2 CRISPR/Cas9在丝状真菌中的应用

2.1 CRISPR/Cas9在酵母中的应用

酵母，一类单细胞真菌，可用于酿造生产，也可为致病菌。目前已知的有1 000多种酵母。根据产生孢子的能力分为3种：子囊菌、担子菌和假酵母。2013年，DiCarlo等［16］使用组成型Cas9瞬时表达gRNA，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中建立CRISPR/Cas9表达体系，表明目标双链断裂可以将单链寡核苷酸的同源重组率提高5倍，双链寡核苷酸供体的同源重组率提高130倍。此外，在稳定表达Cas9的细胞中包含gRNA的质粒和外源DNA的共转化导致近100%的重组频率。此方法为在酵母中进行单位点特异性诱变和等位基因置换提供了一个简单而强大的基因工程工具。

2014年，Bao等［17］报道了基于CRISPR/Cas的多基因编辑体系，可以在酿酒酵母中同时使多个基因产生双链断裂。通过设计携带iCas9（野生型Cas9变体）、反式编码RNA（tracrRNA）和crRNA的超高拷贝数质粒，以大大提高基因破坏效率。结果证明，在4 d内实现了3个内源基因CAN1，ADE2和LYP1的同时中断，当使用不同的靶位点时，整体效率从27%-87%不等。此外，3个参与控制皮质醇生物合成途径的基因ATF2，GCY1和YPR1在6 d内以100%的效率同时被破坏。这种同源结合的CRISPR（HICRISPR）策略将是创建具有多个基因敲除的酵母菌株的有力工具。2015年，Jakočiūnas等［18］也报告了多重CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母中的发展和成功运用，对多达5个不同位点进行了基因编辑。他们应用基因工程工具，对所有可能的单、双、三重、四重和五重基因破坏组合进行分析，找到能大量生产甲羟戊酸的菌株，与野生型菌株相比，该菌株中甲羟戊酸的浓度提高了41倍。该研究结果表明这种多重基因编辑方法加速了功能基因组学和代谢工程的发展。2014年，Jacobs等［19］使用RNA（rrk1）的启动子前导RNA和核酶构建靶向指导RNA的表达载体，与组成型Cas9相结合，在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中实现无筛选标记的特异性诱变，诱变效率接近100%。该体系可以快速有效地在裂殖酵母中进行基因编辑，开启了CRISPR/Cas9技术在裂殖酵母中运用的先河，使得因缺乏用于表达gRNA的RNA Pol III启动子而导致CRISPR/Cas9基因组编辑体系在模式生物裂殖酵母中无法实施的说法不攻自破。2015年，Stovicek等［20］利用CRISPR/Cas9技术在多种不相关的工业酿酒酵母菌株中实现了对一个基因的两个等位基因的同时敲除，效率高达78%。由于酿酒酵母一般是二倍体或者多倍体，因此其基因编辑极具挑战性，该实验也为工业酵母的有效编辑提供了一个良好的平台。同年，Horwitz等［21］在DiCarlo和Bao的基础上利用酵母有利于同源重组的特性，描述了在酿酒酵母中使用CRISPR/Cas系统的简化方法，将多个DNA构建体同时整合到基因组中的目标位置，实现点突变的多重整合，并进行单次转化。该方法将可以对一组基因的功能进行快速检测，并确认完整代谢途径。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种非常规酵母，在污染物、污水处理、工业脂质和柠檬酸生产中有重大意义。2016年，Schwartz等［22］在解脂耶氏酵母中建立了CRISPR/Cas9体系，其中单基因打靶效率高达92%。当使用一种由RNA聚合酶III和tRNA合成的杂合启动子表达gRNA时，效率会有所提高。为了进一步提高效率，使用SCR1’-tRNAGly启动子表达gRNA、UAS1B8-TEF表达密码子优化的cas9，使得编辑效率达到了100%。

2.2 CRISPR/Cas9系统在大型真菌中的应用

2.2.1 灵芝 灵芝（Ganoderma）可以合成多种包括类固醇、生物碱等具有抗肿瘤、抗菌作用的生物活性物质，然而灵芝中URA3基因却阻碍了其中一种重要生物活性物质——灵芝酸的合成。2017年，Qin［23］首次在灵芝中成功建立一个CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统，经过使用密码子优化的Cas9和体外转录的gRNA，在灵芝的基因组中形成双链断裂，从而诱导非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ），促进灵芝中URA3基因的破坏。在此过程中作者首先构建一个CRISPR/Cas9表达载体，其中分别使用来自灵芝基因组的Pgpd启动子和来自里氏木霉的Tpdc终止子来控制Cas9的转录，将Pgpd，glcas9，Tpdc和sdhb 表达盒连接到pMD18-T得到CRISPR/Cas9的表达载体pMD18-Glcas9，运用T7启动子表达gRNAs，并将gRNAs与pMD18-T连接，得到pgRNA-1和pgRNA-2以便体外转录gRNA。然后通过改良的PEG介导的转化法将CRISPR/Cas9表达载体转入灵芝的原生质体中，成功获得能够表达Cas9蛋白的灵芝菌株Gl-Cas9，转化效率高达66.6%。最后将100 μg gRNA转入能够成功表达Cas9蛋白的灵芝菌株Gl-Cas9，在两个位点分别得到3个和5个突变体。从而使灵芝能够产生更多具有抗肿瘤活性和抗转移活性的灵芝酸，成为真正意义上的次级代谢物生产工厂。Qin等的研究不仅促进了对高等真菌的代谢调控的理解，而且通过合理的遗传方法加速了菌株的改良，有望为未来更高级真菌的深入研究和应用提供有用的平台。

2.2.2 灰盖鬼伞 灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）是用于研究子实体发育的典型模式真菌，不仅可以作为食品而且是一种重要的资源，其全基因组的测序完成后，进一步表明它拥有合成萜类化合物、酶的大量关键基因。因此，开发一种适用于灰盖鬼伞的基因编辑技术非常重要。2017年，Sugano等［24］的研究阐明了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法和一种高通量转化方法。实验中首先使用高通量检测分析方法与冷冻保存的原生质体，确定了一个新的启动子——CcDED1pro，该启动子活性高出常规启动子GPD七倍。然后利用CcDED1pro启动子作用于Cas9，来自灰盖鬼伞U6-snRNA启动子作用于gRNA，构建载体。在灰盖鬼伞中开发了高效的基因组编辑体系。最后，利用上述体系在稳定的GFP表达体系中进行CRISPR/ Cas9介导的GFP诱变，并成功检测到了GFP功能的丧失。该方法将为今后在食用菌中进行基因编辑提供更好地参考。

2.3 CRISPR/Cas9在工业菌株中的应用

2.3.1 里氏木霉 里氏木霉（Trichoderma reesei）是最广泛使用的商业木质纤维素分解酶制剂的主要来源，是不同异源蛋白和分泌蛋白质的潜在细胞工厂，常被用来生产多种酶或代谢物。2015年，Liu等［25］在丝状真菌里氏木霉中使用第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9实现了基因敲除，使里氏木霉成为继酵母之后第二个利用CRISPR技术实现基因编辑的丝状真菌。在这项研究中，Liu根据里氏木霉的密码子频率，优化了化脓性链球菌的Cas9基因和核定位信号SV40，并通过融合增强的绿色荧光蛋白（eGFP）对其进行检测，获得能够永久表达cas9蛋白的菌株。由于在里氏木霉中缺乏RNA聚合酶III的启动子，如拟南芥中的U6启动子和酿酒酵母中的SNR52启动子，使用试剂盒在体外转录后将gRNA引入细胞，随后通过同源重组的方式将新序列引入到里氏木霉基因组的靶位点，实现了对其基因组的编辑。最后通过共转化不同靶标的gRNA和外源DNA（dDNA）来同时对多个基因进行修饰，成功构建了适用于里氏木霉中的CRISPR /Cas9多基因编辑系统。实验结果表明，在对单一基因lae1进行编辑时，重组频率根据同源臂长度不同而有所差异，同源臂为0.2 kb-1.0 kb时，重组频率分别为93%和100%。在对lae1和vib1两个基因进行编辑时，效率根据分子浓度比的不同而有所差异，当分子浓度比gRNA-vib1∶dDNA-vib1∶gRNA-lae1∶dDNA-lae1 等于1∶1∶1∶1时，双突变率仅为16%，当比值改为1.5∶1∶1∶1时双突变率增加到45%，表明多个基因的gRNA和dDNA的比例需要优化才能达到高频率的重组。当基因数量增加到3个时，基因编辑效率为4.2%。虽然在多基因编辑时，重组频率较低，却也证明里氏木霉中可以利用CRISPR/Cas9实现3个以上基因的编辑。

2.3.2 产黄青霉 产黄青霉（Penicillium chrysogenum）是青霉属无性丝状真菌，一般分布于土壤、空气及腐败的有机材料等基质中，素以其高效产生青霉素的能力而闻名，此外还能产生多种酶类及有机酸，是重要的工业真菌，在重金属废水处理过程中常被用作吸附剂。2016年，Pohl等［26］开发了强大的无筛选标记的CRISPR/Cas9基因编辑工具用于产黄青霉DS68530（Δhdf A，ΔPen-cluster）和DS54468（Δhdf A）。一方面将体外合成gRNA和Cas9蛋白与外源DNA共同转入DS68530菌株的原生质体中；另一方面，使菌株表达Cas9蛋白，并在细胞中转录或导入体外合成的gRNA。从而获得了amds和pks17突变菌株。由于基于AMA1的表达Cas9的质粒会在无抗性压力时将其丢掉，因此该方法避免了CRISPR/Cas9系统对菌株的影响。

2.3.3 米曲霉菌 米曲霉（Aspergillus oryzae）是一类生产复合酶的菌株，除了可以产生蛋白酶外，还可产生淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和植酸酶等。在日本，米曲霉是用于传统发酵、生产酶和异源蛋白质的重要工业丝状真菌。2013年，Jiang等［27］在米曲霉中建立了基于同源重组的编辑方法，然而这种技术在衍生自野生株RIB40的实验室菌株运用效果较好。由于同源转化体的分离挑战，在工业型菌株中产生ku70和ligD缺失非常困难，因此，发展一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法有重大的意义。这种技术将有助于在许多米曲霉工业菌株中产生有效的靶向诱变。2016年，Katayama等［28］构 建 载 体pUNAFNC9gwA1-4，pUNAFNC9gyA和pUNAFNC9gpG分别用于基因wA、yA、pyrG的突变，其中使用amyB作为cas9的启动子、来自米曲霉RNA聚合酶III识别的U6启动子作为gRNA启动子、SV40作为核定为信号、FLAG-tag作为蛋白表达与否的检验标记。结果显示会在突变体的靶基因位点实现1bp的敲除或插入，基因wA、yA和pyrG的突变率分别为20%、100%和10%，且Cas9的表达不会对米曲霉的生长造成影响。还表明突变率根据基因或PAM序列的不同而有所差别。该技术增加了米曲霉工业菌株中基因工程的广泛运用，有助于其有效的分子育种。

2.3.4 粗糙脉孢菌 粗糙脉孢菌（Neurospora crassa），作为生物遗传学研究的模式生物数百年前已被研究，其中“一种基因一种酶”假说还获得了1958年的诺贝尔奖［29］。但因该菌种缺乏非同源末端连接，因此对于此菌种来说基因编辑始终是一项艰巨的任务。伴随着CRISPR/Cas9技术的出现，各大实验室开始尝试推广使用此技术。2015年，Matsuura等［30］将该技术应用于粗糙脉孢菌，将Cas9基因与trpC启动子、SV40和定位信号、trpC终止子融合，gRNA与SNR52启动子和SUP4侧翼区融合，用β-微管蛋白的启动子替换了粗糙脉孢菌中的clr-2（调节纤维素酶表达的核心转录因子之一）的启动子，并在csr-1基因座处引入gsy-1（调节葡萄糖转化为糖原）启动子控制下的密码子优化的荧光素酶基因。在一定的范围内，cas9和gRNA载体的浓度越高，转化效率越高，且β-微管蛋白启动子驱动的clr-2菌株纤维素酶表达量显著增加，还能用生物发光测定法筛选出表达的荧光素酶的菌株。

2.4 CRISPR/Cas9在致病菌株中的应用

2.4.1 烟曲霉 烟曲霉（Aspergillus fumigatus）存在于谷物、污染的食品、土壤和霉腐物中，是一种无处不在的腐生真菌，在生态系统内的碳和氮循环中起重要作用，但也是使个体免疫受损发、引起人和动物发病的重要病原菌，因此急需更好地了解真菌中的毒性决定因素。然而在真菌病原体烟曲霉中发生同源重组的效率非常低（5%），严重阻碍了其遗传学研究。2015年，Fuller等［31］检测了CRISPR/Cas9在烟曲霉体中进行基因突变的可行性，表明CRISPR/Cas9可以对烟曲霉聚酮合成酶基因（pksP）进行高效率（25%-53%）突变，并成功获得了具有预期基因组改变的突变体。同时设计实验证明，Cas9核酸酶本身的组成型表达对烟曲霉生长无毒害作用。CRISPR/Cas9在烟曲霉基因功能研究中的应用，使CRISPR/Cas9系统与涉及发病机制的研究相结合，更有可能成为这一重要病原体的遗传工具。2016年，Zhang等［32］也在烟曲霉中建立了一个高效的CRISPR/Cas9诱变系统，通过非常短（约35 bp）的同源臂在编辑过程中进行精确高效的整合，准确度约95%-100%，称为微生物学介导的末端连接（Microhomology-mediated end joining，MMEJ）。基于该系统，作者已成功地实现了在预测位点高效和精确的整合外源GFP。此外，Zhang等还发现MMEJ介导的CRISPR/Cas9诱变独立于ku80途径，表明该系统可以作为临床曲霉菌分离株中强大且通用的基因组编辑工具起作用。

2.4.2 玉米黑粉菌 玉米黑粉菌（Ustilago maydis）是一种活体营养型真菌，多年来已经成为研究生物营养型植物病原体相互作用的真菌模型生物之一。它具有最小的真核病原体基因组，可以产生担孢子，但单倍体的玉米黑粉菌并不具有感染力，只有在不同担孢子相互交配后，才能形成具有感染性的二倍体，而b基因是控制其感染性的关键基因。因此，2016年，Schuster 等［33］利用CRISPR/Cas9技术在玉米黑粉菌中建立了高效产生突变体的基因编辑体系。作者使用密码子优化的含有核定位信号和HA标签的Cas9、Potef启动子、gRNA、来源于自身的U6启动子以及酶切后的pMS7构建载体，通过单步转化法将这个可以自我复制的质粒导入玉米黑粉菌SG200，实现了对基因bE2和bW1的编辑，突变效率高达70%。为了消除Cas9基因长期存在对菌株造成的负面影响，编辑成功后使用无抗性压力的培养基，使菌株自然丢弃质粒pMS7。相比第一个在酿酒酵母中建立的无外源DNA插入的CRISPR/Cas9体系，Schuster等的实验说明在玉米黑粉菌中可以更加快速的进行非同源末端重组修复。这项技术将有效破坏功能冗余基因或基因家族，对研究基因在玉米黑粉菌中的作用有很大帮助。

2.4.3 白色念珠菌 白色念珠菌（Candida albicans）是致病性酵母，又称白假丝酵母菌，常导致免疫受损、个体致死性感染，死亡率极高。分子遗传学工具的缺乏是目前对其发病机理分析研究的主要障碍。对于基因或基因家族的功能研究而言，缺乏减数分裂、质粒系统以及白色念珠菌自身染色体数目不受严格控制等使得遗传工程变得更加繁琐［34-37］。2015年，Vyas 等［38］描述了一种运用于白色念珠菌的CRISPR/Cas9系统，克服了该生物体内基因工程的障碍。为了表达一种与念珠菌相容的Cas9，Vyas 等优化了酵母菌的Cas9密码子称为CaCas9，避免使用CUG密码子，确保与所有CTG进化枝物种的相容性。CaCas9由组成型质粒整合位点的ENO1启动子表达，sgRNA由RNA聚合酶III启动子SNR52表达，由于白色念珠菌中不存在可以自主复制的质粒系统，因此通过转化使构建体进入白色念珠菌SC5314的ENO1基因座。为了验证该体系的效果，作者首先对基因ADE2（ade2突变赋予了易于观察的红色表型）进行突变，随后相继获得了基因URA3、RAS1、MtlA1、Mtlα2和TPK2的单突变体菌株，基因CDR1和CDR2的纯合双重突变体菌株；最后分离出许多种功能基因突变体，如dcr1/dcr1突变体、snf1-K81R/snf1-K81R突变体。CRISPR/Cas9针对靶基因的高频率诱导突变使得能够很容易地分离隐性纯合突变体菌株。此外，该系统允许对多个基因进行突变，从而为白色念珠菌的研究奠定了分子基础。

2.4.4 水稻稻瘟病菌 2015年，Arazoe等［39］分别使用内源性RNA聚合酶III识别的U6启动子和RNA聚合酶II识别的TrpC启动子表达的sgRNA，然后与对密码子优化的Cas9基因构建的载体一起通过PEG介导的转化法转入稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）的原生质体中，在模式丝状真菌稻瘟病中建立了CRISPR/Cas9系统，实现了对小柱孢酮脱水酶基因SDH的阻断。结果表明，RNA引导的核酸酶的活性取决于靶基因位置，且RNA聚合酶II识别的TrpC启动子表达核酸酶的活性低于RNAP III识别的U6启动子，但两者都能在SDH位点产生双链断裂。然而对基因SRS2而言，基于TrpC启动子的载体转染所获得的转化体中却未检测到SRS2基因替换。总之，该实验证明RNA介导的核酸酶可以通过同源重组介导的目标基因置换高效率识别所需的序列并编辑内源基因，且U6启动子成为今后在稻瘟病中实现基因编辑的首选启动子。这个系统将为丝状真菌开发各种基于CRISPR/Cas9的应用开辟新的道路。

2.4.5 构巢曲霉、黑曲霉、棘孢曲霉 2015年，Nødvig等［40］通过构建一种特殊的CRISPR/Cas9表达载体尝试在所有真菌中建立通用的CRISPR/Cas9体系。此载体包含复制起点、密码子优化的Cas9、tef1启动子、tef1终止子、SV40核定为信号、gpdA启动子、TrpC终止子、筛选标记（AFUM_pyr G、AN_arg B、bleR和 hygR）、镶嵌在RNA聚合酶II合成的较大转录物中间的gRNA等，根据筛选标记的不同构建了四个不同的载体用于多种菌种。结果显示该体系成功的对构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）的yA基因、棘孢曲霉的albA和pyrG基因进行了突变。此外，作者还发现可以运用同一载体在5种不同的曲霉属菌种中引入albA同源物的特异性突变，以促进在不同丝状真菌中引入常见突变。

3 展望

CRISPR/Cas9基因编辑技术经过4年的发展已经达到了一定的高度。目前，大多数模式生物中都已经实现了基因编辑，相比之前的ZFNs和TALENs系统，CRISPR/Cas9基因编辑技术表现出了极大的优越性，同时也在真菌菌种改良、分子育种等方面表现出巨大的潜力，如已经在缺乏非同源末端连接的粗糙脉孢菌、同源重组率极低的烟曲霉、缺乏减数分裂和质粒系统的白色念珠菌等菌种中成功实现了基因编辑。随着CRISPR/Cas9技术的进一步发展以及人们对其认识的逐渐深入，CRISPR/Cas9将会在大量的丝状真菌中实现编辑，获得更多的研究成果。但是，该技术在应用中仍然存在许多亟待解决的问题，如脱靶、PAM依赖、细胞特异性等。所以，今后在运用该技术时，仍然要对同源臂的长短、质粒的浓度、PAM的选择等进行优化，以期建立一个更加完善的CRISPR/Cas9基因编辑体系。

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