抗体药物糖化检测方法及其生物学功能研究进展

张 斌, 刘晓志, 周敬华, 魏敬双, 高 健, 王志明*

1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 抗体药物研制国家重点实验室, 石家庄 050015; 2.河北省计划生育科学研究院男科实验室, 石家庄 050000

蛋白质糖化反应是发生在蛋白质氨基基团上的一种非酶催化过程，主要发生在赖氨酸侧链的α-氨基胺和ε-氨基胺末端，同还原型糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等发生反应。1912年，Maillard第一次对这种发生在氨基酸和还原糖之间的反应进行了描述。还原型糖的醛基可逆的聚集在胺基周围，两个基团间形成一种不稳定的希夫碱中间体，并自发多级Amadori重排反应，形成更稳定的氨基酮共价键。在一定条件下，氨基酮产物可以将结合的糖残基解离。例如，高度糖化的抗体药物在37℃、pH 7、没有葡萄糖的磷酸盐缓冲液中孵育100 h，总糖基化水平从42%下降到20%，这说明糖化反应是一个可逆反应。

正电荷的伯胺多分布在蛋白质分子表面，但这些位点中只有一部分可以和还原糖分子发生特异反应。研究显示，没有特定氨基酸序列与糖化反应相关。但是，蛋白质局部的三维结构可以影响糖化反应形成。某些蛋白质(例如肝醇脱氢酶、RNase A、 DNaseⅠ、白蛋白、血红蛋白)的组氨酸残基或碱性氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)可能和糖化反应相关。重组人源化单克隆抗体同抗原结合片段的建模实验表明，在49位赖氨酸残基处通常发生高水平的糖化反应，49位赖氨酸残基接近互补决定区2(CDR2)被轻链CDR1的一个天冬氨酸残基进行了催化。同样位于其他重组人源化单克隆抗体重链99位的赖氨酸残基优先发生糖化，因为受到了邻近羧酸的催化。

在高温氧化条件下(包括体内循环)，含有Amadori的糖化蛋白可能被缓慢降解形成晚期糖化终产物(AGEs)。晚期糖化终产物包括羧甲基赖氨酸(CML)、戊糖、吡咯啉和咪唑啉酮。AGEs与某些病理反应有关，如糖尿病、关节炎、动脉粥样硬化相关淀粉样变性以及衰老等。生理性的AGEs形成与氧化和炎症过程相关，而与葡萄糖水平无关，这个过程可能持续几个月或几年。在体内，晚期糖基化修饰的蛋白可诱发AGEs特异性受体的表达，触发抗AGEs蛋白的免疫反应，改变细胞信号转导及细胞功能。AGEs损坏蛋白具有高生物活性，如交联、结构改变以及高度的聚集，这些非正常的结构蛋白可以对许多细胞(如内皮细胞、神经细胞、视网膜和白细胞)产生毒副作用，并且和很多严重疾病相关[1]。许多研究表明糖化血红蛋白水平升高与心血管疾病及动脉粥样硬化有着密切关系[2]。人体的血浆蛋白，如白蛋白、球蛋白、纤维蛋白和胶原蛋白也可能被糖化，进而形成AGEs，AGEs参与了糖尿病并发症的发病过程，糖尿病并发症包括视网膜病变、白内障、神经病变、肾病和心肌病等[3]。有研究认为，高血糖可能在这些疾病的发展中发挥了重要作用，通过诱导蛋白质糖化，从而使蛋白质功能丧失、聚集或沉积。在帕金森病患者的大脑中检测到糖化的Lewy小体。在阿尔茨海默病患者中，β淀粉样肽的糖化加剧了其毒性，加速了神经退行性病变。另外，研究发现糖尿病是多种神经退行性疾病的危险因素，包括帕金森病和阿尔茨海默病。因此，蛋白质糖化成为神经保护治疗干预帕金森和阿尔茨海默氏病的一个新的战略发展方向[4]。在治疗性重组抗体药物生产中，无论蛋白质的糖化水平高低，都没有观察到AGEs的形成。

对于治疗性抗体药物，蛋白质糖化可能对药物产生潜在影响，如阻滞生物学功能或诱导聚集，因此，蛋白质糖化是潜在的关键质量属性(CQA)。因此需要进行深入研究，以揭示抗体药物糖化结构和功能的关系。本文综述了抗体糖化相关的修饰反应、抗体糖化检测方法以及对于生物功能的潜在影响，以期为药物的开发、优化及贮存条件研究提供参考。

1 治疗性抗体的糖化原因

由于治疗抗体生产过程复杂，抗体药物糖化反应并不多见，其反应动力学以及糖化水平不易预测。抗体药物糖化反应多发生在发酵过程中，发酵液中的葡萄糖是工程细胞的重要能量来源。糖化水平和细胞培养过程中总糖的含量相关。为了维持培养基生理条件，培养时需要对培养的温度、pH、时间、离子强度等进行调控，这可能对动力学以及糖化程度产生影响。其中，己糖可以和氨基发生特异反应影响蛋白质糖化，进而增加了抗体药物的异质性[5]。

药物储存过程中，制剂中的还原糖可能通过糖化反应加入到抗体药物中。甚至在冷冻干燥后的固体状态药物，制剂中的还原糖也可以和抗体药物发生糖化反应。制剂中酸度和温度升高会加速蔗糖水解，产生还原性糖，进而导致糖化反应发生。糖化反应的速度也取决于制剂中缓冲盐成分和糖的类型。然而，在优化的存储条件下，药物整体糖化水平很小甚至没有。而有研究显示，制剂溶液的储存温度和储存时间可能影响药物的糖化水平，如4～5℃，1～21个月的制剂溶液稳定性数据显示，药物糖化水平很低；相同制剂储存温度从29℃调整到37℃，1～21个月的数据显示糖化水平显著升高[6]。

抗体药物上有一些潜在的糖化反应位点，但其整体糖化水平通常很低，这给抗体药物的糖化分析和鉴定带来了诸多挑战。为了研究糖化抗体的特性，有研究者利用在抗体易感位点进行强制糖化反应。在强制糖化反应中，抗体药物会和高浓度的还原糖(如葡萄糖或蔗糖)一起高温孵育，高温和低pH会诱使糖化反应加速[7]。

抗体药物在体内循环的过程中也会发生糖化反应。人体内循环系统中内源性IgG的含量大约为10 mg/mL，健康人内源性IgG测定糖基化水平之间的差别很大，每个IgG含有0.14～5个葡萄糖，对应的整体糖化水平为14%～500%。治疗性抗体药物循环系统通常的含量为0.2 mg/mL，对应的整体糖化水平为10%～25%。赖氨酸残基的平均糖化水平接近治疗性抗体，内源性IgG或是人血白蛋白在循环系统中的浓度。在内源性条件下，若IgG不包含高活性糖化位点，那么糖化反应将扩散到整个分子，在所有潜在糖基化位点进行低水平的糖化反应[8]。

2 抗体糖化的分析方法

2.1 硼酸亲和色谱

硼酸亲和色谱(boronate affinity chromatography, BAC)是一种分离和富集顺式二醇化合物的技术。碱性pH条件下，固定相中硼酸官能团会形成一个阴离子四面体，这个四面体可以和糖分子的顺式阵列结构相互作用，进而分离含糖化合物。然后，可以使用降低pH或增加竞争羟基(如山梨醇)的方法洗脱含糖化合物。由于该方法需要检测样品少，并可常温检测，因此BAC常用于抗体糖化的定性和定量检测分析。使用BAC检测治疗性抗体药物时，先洗脱下来的是非糖化峰，最后洗脱出的是糖化峰。为了防止抗体药物同分析柱固相填料之间的非特异性结合，一般在流动相中加入隔离试剂，如Tris等。对隔离试剂浓度、pH和缓冲盐组分进行优化，确定原料药中可以允许的糖化水平。利用BAC结合其他方法可以对收集分离组分的糖化成分进行进一步的研究[9,10]。虽然，BAC被广泛的应用于糖化成分的富集，但它有一定的局限性，因为某些糖基化成分会产生非特异性结合[11]。BAC的定量检测也是估算，因为它不能对蛋白质的单糖化和多糖化进行区分。

2.2 基于电荷的方法

由于糖化位点正电荷的缺失，可以使用毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing, cIEF) 或毛细管等电聚焦成像(imaged capillary electric focusing, icIEF)技术进行检测。将酸性区域充分糖化，将保留硼酸组分同非糖化、非保留酸组分进行比较。毛细管等电聚焦成像检测糖化抗体的分辨率为0.05 pI单位，而理论上一个封闭的赖氨酸残基的差异是0.09 pI单位。这些电荷差分离方法也可以在混合糖化中观察到非糖化硼酸组分。

离子交换色谱法(IEC)也可以检测糖化和非糖化蛋白表面的电荷差异。线性梯度洗脱时，糖化硼酸组分表现为相对主峰的一个特异性迁移。IEC洗脱的酸性变体在一定程度上被富集。Quan等[12]观察到，与最初的普通抗体相比，完全糖化的硼酸抗体已迁移到酸性区域。这个迁移量相当于线性梯度中0.5 mmol/L的氯化钠。对于糖化硼保留片段的IEC峰也明显变宽，而对于非片段起始物，非糖化硼保留片段(非糖化)IEC峰变窄。

总体而言，对于从起始物种分离糖化成分，IEC方法似乎没有足够的分辨率，因为整个分子低水平糖化多个位点具有结合电荷效应。相比之下，由于同树脂独特的相互作用，羧基末端上不结合，以及结合1个或是2个分子赖氨酸残基，使用IEC方法可以将他们依次分离鉴定。

2.3 液相色谱-质谱法

自顶向下质谱常用于分析完整的或酶切抗体分析，也可以用于糖化水平分析。另外，基质辅助激光解吸离子化技术(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)和电离喷雾(electrospray ionization,ESI)技术也可以用于糖化水平分析。由于每个糖化位点会增加162 Da的质量位移，自顶向下质谱常用于抗体糖化水平的快速评估。去糖化和C-末端赖氨酸后，用质谱法测定糖化水平，方法的检测限为1%，定量限为3%，这结果同BAC方法基本一致[13]。

自顶向下质谱肽图方法被用于糖基化位点的确定。由于赖氨酸残基的糖化可以抑制胰蛋白酶的活性，胰蛋白酶活性被抑制并且增加162 Da的分子量，意味着这是一个糖化的赖氨酸位点。BAC截留片段或强制糖化样品的胰蛋白酶肽谱，结果可以显示整个抗体的易糖化位点[14]。

传统质谱方法存在的问题是敏感性低，特别是当用于检测低丰度的糖化抗体药物时。在检测多肽时，问题更加突出，因为糖化反应通常发生在多个赖氨酸残基上。使用传统质谱-自顶向下质谱肽图方法的另一个问题是，串联质谱(MS/MS)实验时，糖分子的碰撞诱导解离反应致使中性水分子不同程度丢失，这对于低水平糖化位点的检测带来了更大的挑战。另一种质谱裂解方式是电子转移解离(ETD)。裂解方法比较的研究显示，ETD方法提供完整的序列片段，没有中性水分子丢失。这些需要更多的糖化分析实验进行确认和验证。另外，减少硼氢化钠或氰基硼氢化钠的使用，再使用胰蛋白酶进行酶切，串联质谱(MS/MS)技术进行肽图分析，这样可以更好的提高检测的灵敏度并减少糖肽的中性丢失。在这种方法中，由于糖化糖减少，碳水化合物和肽之间的化合键稳定，可以达到串联质谱(MS/MS)高质量数据。

液相色谱-质谱(LC-MS/MS)串联是研究AGEs的常用方法。通过肽图对潜在糖化位点进行评价，进而检测AGEs水平[15,16]。一些主要的AGEs(如CML 和CEL)可以通过，修饰肽和所有电荷状态的野生型肽的肽图面积比进行定量。由于AGEs的种类很多，每一种AGEs都需要进行单独定量。除赖氨酸外，精氨酸残基也是抗体药物发生修饰的潜在位点[17]。对α-晶状体球蛋白进行水解，并利用LC-MS对蛋白糖化分布进行分析，结果显示体外与体内的糖化蛋白中赖氨酸残基的糖化修饰不同[18]。

同位素标记也被应用于抗体糖基化分析。有研究者使用抗体药物同12C/13C6还原糖进行1∶1混合，37 ℃孵育进行强制糖化反应。胰蛋白酶对糖化的样品和对照品进行消化，利用LC-MS/MS对样品进行糖化分析。通过给予具有强度相当(相差6.018 Da)的两分子离子一个特异标记，将LC/MS分析胰蛋白酶消化糖肽洗脱产物的方法进行了简化。对强化糖化样品中所有糖化位点进行分析，天然样品中检测糖化肽的分析是简化的。这种方法能够识别特异性糖化位点，不仅检测速度快，还提高了检测灵敏度，糖化水平在0.5%以下也能够被检测[19]。

另一种同位素标记方法包括硼氢化钠还原步骤。在该方法中，样品被分为A和B两等份，分别使用硼氢化钠和硼氘化钠进行还原，再进行胰蛋白酶消化，这导致在糖化肽上分别有2 Da或3 Da分子量的增加。利用LC-MS/MS对1∶1混合的A和B的样品进行分析， 1 Da的分子量差异被用于确认糖化的多肽并计算糖化的相对含量。这些结果表明，当同位素稳定分布并考虑峰重叠时，1 Da的分子量差异足以进行相对定量分析。

2.4 比色法

抗体糖化形成的氨基酮可以用硝基四氮唑蓝(NBT)还原法进行定量检测。1983年，Johnson等[20]首次对检测蛋白糖化的NBT还原法进行了介绍，糖化蛋白的氨基酮组分被NBT还原，从而导致525 nm处吸光值改变。该方法已用于多赖氨酸和糖化白蛋白的检测。2012年，Ahmad等[21]把该方法应用于糖化抗体的检测。最近，Butko等[22]报道了在重组抗体生产中产生的一些AGEs，同抗体溶液的颜色变化密切相关。另外，利用靶向特异AGEs的生物素标记抗体，设计的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法也可用于AGEs检测。

3 对抗体药物生物学功能的影响

研究糖化修饰对单克隆抗体功能影响的报道结果差异巨大，这可能与糖化的数量和位置有关。在一些糖化位点上，强制条件下(总糖化95.4%)或抗体生产细胞生理条件下(糖化10%～40%)发生糖化反应。有研究证实，高糖化水平与高糖溶液下的细胞应激反应、高温储存以及存放时间等条件有关。在正常的细胞培养条件(如温度和pH)下，提高葡萄糖浓度，生产得到的抗体的糖化位点与内源性抗体相似。虽然单克隆抗体糖化通常不会对抗体结合活性产生较大影响，但也可能造成一些抗体活性的丧失。抗体AGEs对活性的影响尚未见报道，但是AGEs可能降低了干扰素a-1的治疗效果。强制糖化抗体的FcRn结合活性研究及小鼠体内模型实验结果显示，一定程度的糖化水平对抗体动力学不产生影响[23]。另外，糖化的核糖核酸酶A无法同核糖核酸酶抑制剂(RI)和DNA结合。同时也发现，这种糖化蛋白不能参与DNA的解链过程[24]。

在免疫原性和安全性方面，典型治疗性单克隆抗体和内源性抗体的恒定区域通常非常相似，所以单克隆抗体的恒定区域的糖化被认为同内源性单克隆抗体类似，因此关注较少。据推测，在抗体恒定区域的赖氨酸残基已经进化为抗糖化形式。关于治疗性抗体糖化的一个担忧是免疫原性问题，尤其是AGEs，AGEs具有较正常抗体更高的免疫原性[21]。

由于炎症、类风湿关节炎患者中发现了AGEs的存在。AGEs破坏性抗体能够触发RA患者免疫系统产生抗IgG自身抗体。AGEs破坏性抗体是一个有效免疫原，可以触发类风湿关节炎患者抗原驱动的自身抗体产生[2,25]。然而，通过细胞培养条件的优化，在抗体药物中AGEs含量非常低或没有[22]。

抗体聚体对于免疫原性和安全性是一个关键质量属性。关于糖化水平和聚集相关性，各报道结论不一，有研究显示二者相关，另有研究将糖化抗体同对照抗体40℃存放1周，没有发现聚体水平差异。对于AGEs，有研究显示AGEs和治疗性抗体降解和交联有关[26]。

4 展望

糖化是一种常见的蛋白质翻译后修饰反应，常发生在治疗蛋白(如，抗体)的生产和储存过程中。BAC和LC-MS是目前分析抗体整体糖化水平的标准方法。由于个别位点的糖化水平很低，因此使用强制糖化方式识别糖化位点。糖化修饰位置影响蛋白的生物活性，并且是抗体特异性的。研究显示，抗体糖化对Fc结合或PK没有造成显著影响[27,28]。为了降低糖化和AGEs形成风险，确保治疗药物的安全性和有效性，应该开发和优化相应的细胞培养、制剂和贮存条件。

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