循环肿瘤细胞在结直肠癌治疗中的研究现状

张文杰，张冰凯，董朔晖，董 浩，刘增林，郑文博，张 翔，王延磊，胡三元，戴 勇

(山东大学齐鲁医院，山东 济南，250012)

随着发病率、死亡率的上升，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)于2016年已成为导致死亡的第三大癌症[1]。因手术、放疗、化疗及靶向治疗的应用，CRC患者的5年、10年生存率达到了65%与58%[2]。即使这样，晚期CRC患者依然容易发生远处转移[3]。多项研究表明，50%～60%的CRC患者在疾病进展过程中会出现远处器官转移[4-5]。复发、转移依然是CRC患者死亡的首要原因。因此，CRC治疗的关键是找到能早期发现疾病并可监测疾病进展的方法[6]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)被认为是癌症患者的一种实时“液体活组织”，可反映疾病进展与预后[7]。一项纳入15个临床研究共3 129例病例的荟萃分析表明，不论采用何种检测方法，外周血CTCs阳性预示CRC患者更差的总生存期(overall survival，OS)[风险比(hazard ratio，HR)＝2.36，95%置信区间(confidence interval，CI)：1.87-2.97，P＝0.006)]及无进展生存期(progression-free survival，PFS)(HR＝1.83，95%CI：1.42-2.36，P＜0.00001)[8]。 此外，单纯 CTCs计数不足以反映肿瘤的异质性状况，研究发现[9]，CTCs可分为不同的亚群，其中间充质CTCs可作为评估肿瘤进展的生物标志物。另有研究表明[10]，部分CTCs表达肿瘤干细胞标记物，在肿瘤形成过程中扮演循环肿瘤干细胞(circulating tumor stem cells，CTSCs)的角色。

1 肿瘤转移与CTCs的形成

部分原发肿瘤细胞经历上皮间质转化等过程获得高侵袭性，从原发组织脱落，侵入周围基质并进入血液循环，成为CTCs。大多数CTCs被机体免疫系统杀死，仅极少数转移倾向极高的CTCs存活下来，并可相互聚集形成循环肿瘤微栓。幸存的CTCs或循环肿瘤微栓离开血液循环，进入到继发脏器的局部微环境，进而逃避宿主的局部非特异免疫杀伤作用，在各类生长因子的作用下增殖生长并最终形成转移灶[11]。

CTCs被认为在肿瘤转移过程中发挥重要作用。有学者创造性地建立了CRC的原位小鼠模型来发展转移并获取CTCs。获取的CTCs成功地在体外进行了培养，并将培养的CTCs重新注入小鼠体内，发现在注射部位迅速生长出了肿瘤，表明CTCs的肿瘤形成能力。同时，他们对这个细胞系的表达谱进行分析，发现与细胞间粘附相关的基因claudin-7、CD166显著下调，表明与来自肝转移瘤的大量肿瘤细胞相比，CTCs更具有转移表型；干细胞标志物 DLG7、BMI1在CTCs中显著上调，这与CTCs更强的肿瘤形成及自我更新能力密切相关。这些发现表明了小鼠来源的CTCs参与肿瘤转移[12]。

2 CTCs的检测技术

2.1 基于化学性质进行富集的检测方法 CellSearch系统是利用上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molcule，Ep-CAM)标记磁珠对上皮细胞进行富集，细胞经固定后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚[2-(4-amidinophenyl)-6-indole carbamidine dihydrochloride，DAPI]荧光染料标记细胞核，CD45荧光抗体及CK8、CK18、CK19或CKmix荧光抗体标记细胞，结果分析在四色荧光显微镜下进行。将DAPI+、CD45-、CK+及Ep-CAM+的细胞定义为CTCs。CellSearch系统的优点是细胞形态结构能较好地保存，即荧光显微镜不但能看到荧光染色的结果，还能观察肿瘤细胞的形态，且已有商品化的半自动检测仪器简化操作过程。缺点是采用上皮细胞标志筛选将遗漏发生上皮间质转化的肿瘤细胞，检测结果具有较高的假阴性率[13]。

LiquidBiopsy 平 台(Cynvenio Biosystems，Westlake Village，CA，USA)通过最初与 DAPI、CK、CD45 抗体、Ep-CAM-生物素抗体进行差异性免疫染色来富集CTCs，再加入生物素蛋白-铁磁流体抗体用于磁固定，再使用高通量基因测序进一步分析。其优点是能处理相对大量的血液样本，特定肿瘤细胞的捕获率可达到70%以上，纯度可达10%，同时可集成到实验室流程中，实现CTCs计数并提供高纯度样品用于分子分析。但由于采用了与CellSearch系统类似的检测原理，仍存在假阴性率较高的问题[14]。

Epic 系统(Epic Sciences Inc.，San Diego，CA，USA)除红细胞裂解外没有富集步骤。所有有核细胞沉积在载玻片上，再进行差异免疫染色鉴别CTCs。由于考虑到上皮间质转化、循环肿瘤微栓、凋亡的存在，Epic系统一定程度上解决了假阴性率问题，在验证性试验中体现了比较好的敏感性、特异性及线性，除了同样可整合荧光原位杂交技术、高通量基因测序等下游功能，此系统一个重要特征是具有患者载玻片的生物储存库的能力，可用于回顾性生物标记分析[15]。

Saucedo-Zeni等[16]已发明了基于Ep-CAM抗体标记原理的医疗器械，仅需将其放置于外周静脉中即可于体内对CTCs进行初筛，然后将初筛的CTCs在体外进一步鉴别；其优点是克服了少量血液样本中CTCs稀少难以富集的困难，可在全身血液中捕获CTCs，提高了富集效率。

2.2 基于物理性质进行富集的检测方法 ISET(RareCells Diagnostics，Paris，France)利用CTCs的较大尺寸及更多结构刚性的特性进行富集。其核心部件是一个过滤器，过滤器内分布有一定直径的滤孔滤膜，最后根据形态特征对富集的CTCs进行鉴别。相较实时聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)，ISET 具有更高的灵敏度，所需血液标本的量更少，结合免疫细胞化学、免疫荧光等下游功能，可对CTCs进行更深入的分析[17]。

Parsortix平台(ANGLE plc，Guildford，UK)采用微流体原理，不仅考虑到了富集过程中CTCs的大小特性，对其变形能力也有一定考量。通过对富集的CTCs进行免疫组化鉴定，发现该平台对于不同来源肿瘤细胞的捕获率为42%～70%，纯度约1%。可贵的是，经过分离获得CTCs，99%是有活性的。与CellSearch系统相比，两者在CTCs捕获率方面差异无统计学意义[18]。

FMSA 系统(Pennsylvania State University，Department of Biomedical Engineering，State College，PA，USA)是一种新型灵活微型弹簧阵列装置，与以前的微过滤装置不同，微型弹簧阵列的柔性结构可最大限度地减少细胞损伤，以保存活力，同时最大限度地提高过滤速度。其平均捕获率为90%，存活率高于80%，在与CellSearch系统的对比试验中，FMSA系统显示出更高的灵敏度[19]。

OncoQuick系统(Greiner Bio-One International GmbH，Germany)采用物理过滤原理的同时进行密度梯度离心来分离CTCs，再采用RT-PCR进行鉴定。这种新密度梯度离心法与标准方法Ficoll相比，OncoQuick显著提高了纯度，肿瘤细胞捕获率也有一定程度的提高[20]。

AccuCyte系统(RareCyte，Seattle，WA，USA)则采用了将密度离心、免疫染色及全外显子测序结合起来的设计思路，AccuCyte系统可提供高分辨率图像，通过形态、表型特征识别CTCs，捕获率为90%～91%。在某些血液标本中，其捕获的CTCs数量显著高于CellSearch系统[21]。

DEPArray系统(Menarini Silicon Biosystems，Castel Maggiore，Italy)利用 CTCs独特的电性质，采用双电流技术对CTCs进行检测。此技术需要预先使用OncoQuick系统对CTCs进行富集，捕获率受目标细胞数量影响，为11.6～86.0%[22]。

声学分离是利用细胞尺寸、可压缩性差异来分离不同的细胞类型[23]。有研究人员设计的声学流式细胞仪已实现从血液中高通量分离CTCs，其捕获率超过83%，可去除90%以上的杂质细胞，同时对细胞活力没有显著影响[24]。

3 CTCs在CRC治疗中的作用

最近，一项纳入12项通过RT-PCR检测外周血CTCs的临床研究共2 363例非转移性CRC患者的荟萃分析表明，不管何种TNM分期、何时进行采样、是否进行新辅助治疗，CTCs阳性均意味着更差的 OS(HR＝3.07，95%CI：2.05-4.624，P＜0.001)与PFS(HR＝ 2.58，95%CI：2.00-3.32，P＜0.001)。 同时，区域淋巴结转移(RR＝1.62，95%CI：1.17-2.23，P＝0.003)、浸润深度(RR＝1.41，95%CI：1.03-1.92，P＝0.03)、血管侵犯(RR＝1.66，95%CI：1.17-2.36，P＝0.004)、肿瘤级别(RR＝1.19，95%CI：1.02-1.40，P＝0.029)、TNM 分期(RR＝0.76，95%CI：0.71-0.81，P＜0.001)与 CTCs阳性密切相关。这些证据表明，与影像学相比，CTCs的临床应用价值在于可更早地预测肿瘤转移[25]。同时Zhao等[26]发现，肠系膜下静脉血中检测到的CTCs较外周血更多，表明肝脏可减少CTCs的数量。Wind等[27]进一步发现，与术前相比，术中CTCs的检出率、数量显著增加，并且腹腔镜手术中检测到的CTCs少于开腹手术[27]。Zhao等还发现CTCs阳性患者往往伴随血清CEA、CA19-9水平升高。即使在非转移性CRC患者外周血几乎检测不到的CTCs的情况下，血清CA19-9与肠系膜下静脉CTCs水平也呈现相关性。这些结果表明，在肠系膜下静脉使用CellSearch系统检测CTCs更具有临床意义，血清CA19-9水平可帮助进一步评估肠系膜下静脉CTCs水平[26]。不同于CA19-9，Ki67指数对CRC患者预后的提示作用独立于CTCs计数[28]。

对于转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)患者，Kaifi等[29]发现肝肿瘤负荷越大，血清CEA水平越高，检测到的CTCs数量越多[29]。但Das等[30]的研究表明，CTCs计数与肝肺转移瘤没有关系，这项基于21例mCRC患者的联合化疗实验还发现，11例开始化疗后立即出现CTCs计数下降，5例化疗结束时与基线水平相比CTCs计数下降，这提示我们CTCs联合血清CEA有助于评估化疗mCRC患者的化疗反应。多药联合对晚期CRC仍然有效，但会使化疗产生的副作用明显增加，CTCs计数可识别可能获益更多的患者，避免对无获益者采取高毒性方案[31]。在基因层面，原发肿瘤与CTCs的KRAS突变水平是一致的，当原发肿瘤难以获得时，CTCs可作为替代选择，甚至可更精确地动态预测mCRC患者对靶向治疗的反应[32-33]。一项纳入38例接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗的mCRC患者的前瞻性研究分别在基线(治疗前)、早期(治疗后2～4周)及晚期(治疗后8～10周)测定CTCs水平，发现早期CTCs阳性与阴性患者的PFS(中位数，2.0 vs.4.0个月，P＝0.004)、OS(4.7 vs.11.4，P＝0.039)差异有统计学意义，治疗期间CTCs的变化情况是PFS、OS的独立预测因素，其对靶向治疗反应的评估作用早于影像学检查[34]。虽然西妥昔单抗的治疗原理是基于表皮生长因子受体，但有研究显示[35]，表皮生长因子受体在CTCs中是否表达对靶向治疗反应的影响差异无统计学意义。

CTCs作为CRC患者预后的独立预测因子正得到越来越多的接受，但多数用于检测CTCs的技术显示出低灵敏度、特异性。因此，Chen等[36]试图找到CTCs的替代标记物。他们从90例CRC患者、151例健康志愿者的1.5 mL外周血中所含的CTCs直接提取RNA，然后通过RT-PCR筛选候选标记基因，成功鉴定了上皮细胞转化序列2基因具有高差异表达比率(P＜0.01)。上皮细胞转化序列2基因显示出良好的灵敏度与特异性，可作为替代的测量方法弥补目前CTCs检测在CRC患者诊断与监测中的不足。

4 CTCs亚群及CTSCs与CRC

虽然CTCs计数作为CRC进展及治疗反应的潜在标记物已被广泛接受，但对这些细胞异质性缺乏认识已成为将其应用于临床的瓶颈。Cui等[9]根据上皮细胞、间质细胞标志物的表达情况，将CTCs分为上皮型、混合型、间质型，发现在CRC患者中，间质型随着肿瘤进展而显著增加，且间质型阳性与CRC患者远处转移的发生显著相关。Malara等[37]则将结肠癌患者血液中分离出的CTCs分为CTSCs亚群(CD45-CD133+)、循环分化细胞(趋化因子受体4亚群+CK20+)。生存分析结果表明，CTSCs亚群对应更差的OS，而循环分化细胞亚群则对应更差的PFS。对于CD26+CD326-的CTCs亚群，有研究发现CRC患者术前高水平的CD26+CD326-的CTCs正确预测了44.4%的肿瘤复发，而术后高水平的CD26+CD326-的CTCs正确预测了69%的肿瘤复发，准确性为88.8%。相比之下，术后CD26+CD326-的CTCs阴性患者的三年无进展生存率增加86%，同时肿瘤复发风险降低大于90%。因此，CD26+CD326-的CTCs可作为CRC复发的独立预后因子[38]。

CTSCs代表了基于其干细胞特性、侵入性而具有转移起始能力的CTCs独特亚群，因此对于CRC患者的预后是至关重要的。Grillet等建立多个体外CTCs细胞系，发现所有CTCs细胞系在皮下异种移植物中是致瘤性的，并且在脾内注射后也能定植于肝脏。虽然CTCs在血细胞中很少，但在遗传、表型上是异质的。对单克隆的CTCs进行分析，其中部分单克隆系仍呈现异质性并高表达CTSCs标记，直接表明CRC患者来源的部分CTCs具有CTSCs的所有功能属性。同时，与化疗药物抗性相关的基因也呈高表达状态，药物敏感性试验发现不同细胞系的药物敏感性存在差异，这强烈提示我们CRC患者需要个性化治疗[39]。与非致瘤性的CTCs相比，CTSCs不仅能从原发性肿瘤脱落，而且能逃避免疫监视，在循环血液中存活并随后在远处器官中形成转移。因此，CTSCs可能是预防CRC进展的潜在治疗靶点[40]。目前报道的主要 CTSCs标志物包括 CD133、CD44、CD166、Ep-CAM、CD24、CD26、CD29、ALDH1 等。 尽管不同的细胞表面标记已用于表征与分离CTSCs，但迄今尚无鉴定CTSCs的良好标记物。Meng等[41]发现，与传统 CD133+或 CD44+的CTCs细胞相比，CD262+的CTCs在培养的肿瘤球体中形成更多的肿瘤球，表现出更高的化学耐受性，在裸鼠中移植后发生肿瘤的比例更高，并且发生远端转移瘤的频率更高。此外，当皮下移植CD262+的CTCs细胞时，在循环中能更频繁地检测到CTCs。研究发现，Ⅲ期CRC CTCs中CD44变体外显子9阴性患者的5年生存率为89%，而阳性表达患者的5年生存率为52.4%(P＜0.05)。对于Ⅳ期不可切除的CRC患者而言，CD44变体外显子9阴性表达患者的2年生存率为70.1%，而阳性表达患者的 2年生存率为 33.3%(P＜0.05)[42]。Fang等[43]发现联合影像学、血清 CEA水平及CD133+、CD44+、CD54+的CTCs检测可提高CRC肝转移检出率，灵敏度为 88.2%，特异度为 92.4%。 同时，CD133+、CD44+、CD54+的CTCs高表达意味着更短的生存期，其对预后的提示作用在肝转移瘤无法切除的CRC患者中更明显[44]。不同于CTCs，CTSCs(CD133+Ep-CAM+)数量在肝门静脉血、外周血中的差异无统计学意义，因此，我们可能无法从门脉系统中获取更多的CTSCs[45]。

CRC中CTCs的检测有助于肿瘤的早期诊断及预后判断，同时还可用于抗肿瘤药物的疗效评估及制定个体化治疗方案，是一种具有高度可行性及可重复性的非侵入性新型诊断工具。目前阻碍我们深入认识CTCs的两个重要障碍是它们的稀缺性与异质性。越来越多的新方法使CTCs的富集效率大大提高，新的标记物组合有效降低了假阳性率、假阴性率，但仍难以覆盖随疾病进展不断发生纵向变化的所有CTCs，期待更加完善的检测方法。同时，越来越多的证据表明CTCs动态异质性的存在，仅仅依据CTCs计数无法对CRC进行全面而精确的评估，不同CTCs亚群在CRC发生与发展过程中扮演着不同的角色。CTSCs作为具有干细胞特性的独特亚群，其作用不言而喻，可能是早期发现、阻断肿瘤发生与转移的关键。相较CTCs，更加稀缺且更加神秘的CTSCs吸引着我们去揭开其神秘的面纱，多种标志物组合仍是鉴别CTSCs的主要手段。CTCs体外模型的建立不仅为CTCs及CTSCs研究开辟了更广阔的空间，而且为CRC患者制定个体化治疗方案提供了无限可能。总之，基于CTCs的个体化、实时性治疗会是CTCs应用于CRC治疗的发展趋势。