哮喘动物模型建立的研究进展

张睦涵 朱振刚

(1.天津中医药大学，天津 300193)(2.天津中医药大学第一附属医院呼吸科，天津 300193)

支气管哮喘(bronchial asthma)简称“哮喘”，是一种由多种细胞组分及复杂细胞因子网络参与的，对过敏性与非过敏性因素做出特异性反应的一种慢性气道炎症性疾病，被认为是造成医疗卫生高负担的临床最常见的慢性病之一[1]。哮喘防治的关键在于对哮喘发病各环节分子机制的深入研究，从而从病因学、基因水平研制出针对哮喘的靶向治疗药物，而新药研究都需要进行前期细胞实验和动物实验，因此建立与人类哮喘病理生理及临床变化高度拟合的哮喘实验动物模型一直是哮喘实验研究的基础和中心环节,因此笔者查阅了最近10年有关哮喘动物建模及评价方面的有关文献，从模型动物选择及哮喘模型类型两方面总结哮喘动物模型的研究进展，期望对哮喘的临床及实验研究有所裨益。

1 模型动物

1.1 小鼠

小鼠作为模型动物广泛应用于人类多个系统的疾病研究中。小鼠的基因组背景纯净，品系丰富，生物学试剂及抗体完备且性价比高,可复制出哮喘经典的气道高反应、气道慢性炎症、黏液增多等症状，有文献报道成功复制小鼠气道重构模型.故其虽有体积小，操作及取材较困难，造模需要多次致敏和激发等缺点，目前仍为支气管哮喘研究最为常用的动物模型。常用的小鼠品系为BALB/c、C57BL/6，A/J、CBA、C3H等，以前两种品系最常用。

1.2 大鼠

大鼠应用于哮喘造模研究不如小鼠充分，因为其虽然也有品系纯，来源广，价格较便宜等优点，且分子生物学试剂较多，标本采集量远比小鼠充足，对致敏原激发反应较为一致，能出现与人类哮喘类似的速发相及迟发相变态反应，但大鼠模型在模拟人类哮喘嗜酸细胞脱颗粒等关键节点上差异较大，故目前对应用大鼠建立哮喘动物模型的科学性上存在较大争议。

1.3 豚鼠

豚鼠哮喘模型是最早及最经典的动物哮喘模型，在1976年就有应用卵清蛋白(OVA)建立豚鼠哮喘模型的报道[2]，后来随着研究的深入文献报道很多，Ressmever等[3]也认为豚鼠在气道药理模型上比大鼠及小鼠更合适。但应用豚鼠建立哮喘动物模型的缺点也是显而易见的。豚鼠的相关生物学抗体较少，敏感性强，个体反应差异大，导致出现不致敏或过度反应死亡的情况，影响造模成功率，且豚鼠价格较小鼠和大鼠而言较为昂贵，会导致研究成本的增加，故近年来豚鼠用于支气管哮喘建模有逐步减少的趋势。试验豚鼠多数研究选择雄性豚鼠，鼠龄25～35 d，体质量150～250 g，造模方法一般为：实验第1 d腹腔注射10% OVA 1 mL致敏，2周后以1% OVA雾化激发诱喘，每日1次直至哮喘典型症状出现。李海银等[4]应用OVA联合弗氏佐剂致敏豚鼠建立了中性粒细胞哮喘的豚鼠模型。

1.4 其他动物

除目前常用的大鼠、小鼠、豚鼠外还有一些相对大型的动物可以选择，例如猫可发生类似于人类慢性哮喘的支气管疾病; 马可以形成以中性粒细胞升高为主的呼吸道疾病，它有哮喘的一些特点，可能与慢性阻塞性肺疾病的联系更加密切；已知羊和犬对某些变应原天生就敏感[5]，猴的免疫系统和人非常相似，但是存在动物来源及实验成本的限制，研究与应用都相对较少。

2 模型类型

2.1 过敏性哮喘模型

过敏性哮喘动物模型是目前研究最广泛，也是与人类哮喘病理生理机制最接近的哮喘模型类型。过敏性哮喘的造模剂常有卵清蛋白、花粉和有机粉尘等，其中卵清蛋白致敏研究最充分，模型最成熟，不再赘述。季节性哮喘的诱因主要是花粉和真菌蛋白等致敏，建立此类模型对研究变应性哮喘有很大意义。李雅莉等[6]应用蓬草花粉粗浸液致敏激发的BALE /C小鼠建模，具体方法为:首先于第一天腹腔注射300μg蓬草花粉粗浸液加氢氧化铝凝胶2 mg致敏，之后第7、14天后加强致敏，第24天给予30 μL(10 g/L)蓬草花粉粗浸液滴鼻激发，每日1次，连续5次激发。在有机粉尘致敏方面，应用于诱发支气管哮喘模型研究较多的是屋尘螨及蟑螂。最近国外相关屋尘螨所致哮喘模型的建立方法都是以鼻内滴入屋尘螨3～6周[7-8]，朱艳芬等[9]研究了不同浓度致敏激发下小鼠支气管哮喘气道重构模型，其存在明显的剂量效应关系及时效关系，结果显示高浓度屋尘螨提取物处理9周时气道重构表现最为明显。

2.2 感染性哮喘模型

感染性哮喘的经典模型是应用呼吸道合胞病毒(respiratory syncyialvirues，RSV)，内毒素、脂多糖等致敏。蒋雄斌等[10]研究表明，RSV感染可致OVA致敏激发的哮喘小鼠呼吸道炎症明显加重，气道高反应性及其时间明显延长。张雷英等[11]研究了时期因素对哮喘模型的影响，发现致敏前感染RSV明显抑制OVA诱导的肺部炎症，但致敏后感染RSV则对OVA诱发的气道变态炎症无明显影响。Newcomb等[12]则发现IL-17 A基因敲除的小鼠比野生小鼠在经OVA及RSV致敏激发的过程中表现出了更强烈的气道高反应性和气道炎症症状。

2.3 职业性哮喘模型

职业性哮喘的定义是由工作场所特定的环境因素所诱发的哮喘病症，其临床症状和其他哮喘类型相似，表现为可逆的气道阻塞，非特异性气道高反应性。流行病学调查认为哮喘发病率上升和过去数十年工业化进程加速导致的职业暴露密切相关。而各种各样的环境因素，特别是大量的富含可吸入蛋白的人造化合物和环境污染物，被认为是导致职业性哮喘的主要诱因[13]。有证据表明环境抗原能造成非特异性血清IGE升高，这被认为和其引起的哮喘症状相关。Tarkowski等人用2.0 mg/m3的气态甲醛预处理BALB/C小鼠10 d，每天6 h，小鼠产生的血清(其他过敏原)特异性IGE较未处理组抗体含量提高3倍。

2.4 肥胖哮喘模型

随着国民饮食结构的嬗变，肥胖人群比重不断上升，相关健康问题也引起学术界注意。肥胖在哮喘发生、发展中的作用逐渐受到重视[14-15],2006版GINA将高体块指数列为哮喘的独立危险因素之一。国外多采用基因缺陷或高脂饮食诱导建立肥胖动物哮喘模型，以进行相关研究[16]。但人类多为单纯性肥胖引起哮喘症状，故前者有一定局限，而后者所用纯化配方饲料具有造价高的问题[17]。我国学者夏宇和黄英[15]采用不含致敏原的自制高脂饲料喂养、卵清蛋白致敏激发C57BL/6 J小鼠，成功建立了肥胖哮喘动物模型。

2.5 中性粒细胞性哮喘模型

嗜酸细胞在哮喘发病中的中心地位已广为人知，然而最近的研究提示中性粒细胞(neutrophil,NEU)在哮喘炎症浸润过程中也有重要影响。Douwes等[18]发现约50%的哮喘患者存在气道NEU浸润，且NEU与重症哮喘[19]、迟发型哮喘[20]、激素不敏感型哮喘[21]有密切联系。2006年Simpson 等[22]将诱导痰中中性粒细胞百分比(NEU%)>61%的哮喘患者定义为中性粒细胞哮喘(neutrophilicasthma,NA)。诸多学者从各个方面尝试复制中性粒细胞哮喘动物模型。迄今为止，OVA是制备中性粒细胞哮喘动物模型最常用的致敏原，有单纯OVA和复合OVA(含佐剂)两种，以复合OVA较常用。除了致敏原以外，细菌内毒素(LPS)[23]、环境污染[24]、香烟烟雾[25]、支原体感染[26]等许多非过敏性因素也可导致哮喘患者或小鼠气道NEU增多，活性增强，并与AHR有关，因此通常采用OVA联合非过敏因素建立中性粒细胞哮喘实验动物模型。

2.6 难治性哮喘模型

哮喘患者中有一组人群，我们称之为难治性哮喘。这里所说的难治，并不是说所有严重的，甚至危及生命的哮喘类型，而是指当使用最大推荐剂量的吸入治疗后，仍未有效地控制的哮喘。难治性哮喘约占整个哮喘人群的20%。但这类人群所花费的费用占整个哮喘人群的80%[27]。关于难治性哮喘模型的复制目前尚无权威方案。徐世军等认为过敏性豚鼠哮喘模型结合变应原反复刺激造模、过敏性豚鼠哮喘模型结合反复呼吸道感染造模、过敏性豚鼠哮喘模型结合呼吸道合胞病毒等病毒感染造模及过敏性与运动性哮喘相结合造模等思路有望成功复制难治性哮喘模型。

2.7 哮喘气道重塑模型

气道重塑是哮喘慢性化后面临的重要问题，和激素抵抗、哮喘反复发作、哮喘-慢阻肺综合征等相关。哮喘气道重塑是一个不断发展的过程，从炎症细胞浸润到气道内腺体的增殖和肥大，最终导致基底膜和气道平滑肌增厚，引起不可逆性气流受限和非特异性的气道高反应性[28]。气道重塑的发生代表哮喘病程从炎症性病变到结构改变的转化趋势，目前来看涉及分子机制较为复杂，是哮喘研究的挑战之一[29]。因此复制与人类哮喘气道重塑病理特征相似的动物模型也是哮喘实验研究的重要组成。陈宝生等[30]以雄性豚鼠作为实验对象，通过卵清蛋白腹腔注射致敏雾化吸入激发的方法复制哮喘气道重塑动物模型。采用连续10周雾化的长程干预措施后发现豚鼠出现血氧分压降低，提示气道重塑模型复制成功。

2.8 激素抵抗型哮喘模型

随着糖皮质激素在临床上的广泛应用，以及环境、精神、心理等因素的影响，部分哮喘患者哮喘症状反复发作，并对糖皮质激素的敏感度明显降低，因此一种新的哮喘类型-激素抵抗型哮喘(steroid resistant asthma，SRA)也得到广泛的关注，建立SRA动物模型的方法也在积极的研究中[31]。研究人员发现，持续的抗原暴露、激素治疗不合理中断可影响支气管哮喘的控制[32-33]。文莎和吴峰[34]通过普通级BALB/C雌性小鼠采用卵清白蛋白(OVA)致敏、激发造模，予地塞米松干预并连续雾化9周，结果成功复制激素抵抗型小鼠哮喘模型，说明反复抗原刺激联合地塞米松中断性干预建立小鼠SRA模型的方法切实可行。

3 结语

基于近十年国内外支气管哮喘动物造模方面相关研究可以发现，小鼠是哮喘动物模型建立中最常使用的动物。过敏性哮喘是被最充分复制的哮喘模型，其病理生理学变化研究最为充分。卵清蛋白致敏、激发是最常用的哮喘造模方法。不少学者也注意到支气管哮喘疾病本身的异质性，激素抵抗哮喘、中性粒细胞哮喘等基于哮喘表型的分类方法也影响了哮喘动物模型的研究。哮喘实验动物模型的研究趋于细化，对哮喘气道重塑、难治性哮喘的动物模型研究也从无到有。随着有机粉尘暴露的增加，越来越多的职业相关性哮喘动物模型被成功复制。今后的哮喘动物模型研究必将沿着与临床更加紧密、结合哮喘表型、结合基因工程学研究的道路不断前进。