外泌体在头颈部恶性肿瘤中的研究进展

黄 强(综述) 周 梁(审校)

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科 上海 200031)

外泌体是直径30～100 nm、起源于多泡体(multivesicular Body,MVB)的细胞外囊泡。其具有磷脂双分子层结构,表面表达CD9、CD63等具有特征性的标志蛋白,外泌体内包裹着包括mRNA、ncRNA、蛋白质和脂质等在内的物质。起初,研究者们认为外泌体是转运细胞内代谢产物的工具,但是目前越来越多的证据显示外泌体在介导细胞间通讯[1]、调节免疫反应[2]、诱导肿瘤细胞耐药[3]和转移[4]等方面发挥着巨大作用,更印证了Paget[5]提出的“种子与土壤”假说[6]。而头颈部恶性肿瘤作为全身常见的恶性肿瘤之一,化疗耐药、淋巴结转移等问题一直困扰着广大临床工作者和研究人员,因此本文就目前关于外泌体在鼻咽癌、舌癌、喉癌以及口腔鳞癌等头颈部恶性肿瘤中的研究进展作一综述。

外泌体与鼻咽癌鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是鼻咽部上皮组织常见的恶性肿瘤,在我国两广地区具有较高的发病率[7],大于60%的NPC患者就诊时已经有局部淋巴结浸润[8]。因此,更加深刻地认识NPC的内在机制变得尤为关键。目前在NPC外泌体方面的研究成果较多,外泌体在肿瘤发生发展、演化以及诊断和预后方面都具有极为重要的作用

外泌体miRNA与NPC miRNA是一类具有高度保守性的长度在20～24 nt之间的内源性非编码RNA,能够通过降解或抑制靶mRNA调节转录后水平的基因表达。在肿瘤发生发展演化中扮演了十分重要的角色。众所周知,NPC与EBV感染密切相关,而Pegtel等[9]率先发现病毒miRNA可通过外泌体运输的方式传递给未被病毒感染的细胞。Gourzones等[10]也证实在裸鼠种植模型和患者血清中都能较为特异性地探测到EBV感染的NPC细胞分泌的含有mir-BART7-3p的外泌体,这些发现有望成为潜在的鉴别NPC和非NPC的肿瘤生物标记物。

NPC细胞通过释放富含miRNA的外泌体促使其适应不断变化的微环境。Harmati等[11]使用阿霉素以及光敏剂Ag-Tio2刺激NPC细胞株5-8F,均可显著增加外泌体数量并能改变外泌体中miRNA的表达谱,而其中变化幅度最显著的均是作为癌基因而存在的miRNA。这提示在外界环境不佳的条件下,肿瘤细胞可以通过释放有利于肿瘤进展的miRNA从而促进其恶性表型以及转移形成等过程。

外泌体miRNA参与调控NPC细胞增殖、侵袭以及免疫调节从而促进肿瘤发展。Ye等[12]通过miRNA芯片技术比较了NPC患者血清以及TW03细胞系来源的外泌体,发现均存在miR-24-3p、miR-891a、miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-1908的显著升高,生物信息学分析推测这些miRNA可能参与了MARK1信号通路的下调,从而影响了细胞的增殖和分化。其中TW03细胞系来源的外泌体可通过抑制T细胞增殖和Th1/Th17细胞分化以及诱导促进Treg细胞的产生,从而削弱T细胞的功能,并通过促进CD4+或者CD8+细胞释放促炎因子 IL-1β、IL-6和IL-10以及减少IFNγ、IL-2、IL-17等抑炎因子等来调控肿瘤免疫微环境。后续实验[13]则证实了与T细胞增殖分化等密切相关的纤维母细胞生长因子11(fibroblast growth factor 11,FGF11) 是miR-24-3p的直接靶点,外泌体miR-24-3p可通过抑制FGF11的表达从而抑制T细胞功能。相反地,通过靶向miR-24-3p的RNA海绵特异性敲低外泌体miR-24-3p的表达水平可以恢复T细胞增殖和Th1/Th17细胞分化的能力。这均说明了外泌体miRNA在NPC发生、发展以及演化过程中发挥着重要作用。

外泌体LMP1与NPC 潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)被认为是EBV感染B淋巴细胞过程中最为重要的癌基因,并与细胞生长调控以及增殖过程密切相关[14]。Dukers等[15]首先揭示了LMP1与外泌体之间的潜在联系。而Meckes等[16]经过进一步实验,发现NPC源性外泌体内高表达的LMP1不仅可以增加受体细胞及受体细胞外泌体内表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的含量,而且高表达的LMP1与EGFR的外泌体被内皮细胞、成纤维细胞等摄取后通过激活ERK和PI3K/Akt信号通路参与细胞增殖等过程。这提示外泌体LMP1可以影响外泌体组分及其性状,参与并直接调控肿瘤细胞增殖等恶性进程。

另外从间接调控方面来看,Aga等[17]发现LMP1能增加外泌体内缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)的表达,而HIF-1α是肿瘤细胞恶性转化以及发展中的关键转录因子,直接促进了肿瘤发展;Ceccarelli等[18]则证实NPC细胞中LMP1的表达能显著增加肿瘤细胞外泌体中纤维母细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)的表达,而后者被认为是具有促进血管生成作用的潜在促癌因子。

这些研究均证实外泌体LMP1能从直接调控和间接调控两方面影响着NPC的进展。鉴于此,靶向LMP1的治疗显得尤为关键。有研究[19]发现,在LMP1定向分拣进入外泌体的过程中CD63扮演着重要的角色,用CRISPR/Cas9技术敲除CD63后发现细胞外泌体中LMP1的含量明显下降。这指明了一种阻断LMP1下游信号通路的策略,同时也为治疗NPC提供了一种新的思路。

外泌体Galectin9与NPC 半乳凝素9(galectin-9,Gal-9)在调节T细胞生物学作用、自身免疫以及炎性反应中具有重要作用[20]。有研究[21-22]证实,EBV感染的NPC细胞产生富含Gal-9的外泌体,而Gal-9是成熟Th1细胞膜表面死亡受体Tim-3的特异性激动剂[23],两者结合可介导成熟Th1细胞的凋亡过程。Klibi等[22]发现通过阻断外泌体中的Gal-9/Tim-3的相互作用,可以显著减缓对Th1细胞的抑制并增强其抗肿瘤作用。说明外泌体Gal-9在促进调节性T细胞生长、诱导成熟的CD4+Th1+凋亡方面具有重要作用,提示肿瘤细胞可能通过产生外泌体以逃脱免疫监视[24],这也预示着此种策略可作为治疗NPC的免疫疗法之一。

外泌体其他内容物与NPC Shi等[25]证实间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)可以产生高表达纤维母细胞生长因子19(fibroblast growth factor 19,FGF19)的外泌体,与NPC细胞共培养后发现其可以通过FGF19-FGFR4依赖的级联式ERK信号通路影响NPC细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的过程,从而参与到肿瘤细胞恶性进展的过程中。这也更加深刻地指明除了肿瘤本身产生的外泌体对其的作用外,间充质干细胞来源的外泌体等因素对肿瘤的影响。

除此之外,在NPC细胞外泌体中还存在种类繁多的与其发生发展密切相关的因子,包括HS1相关蛋白X-1(HAX-1)[26]、HIF-1α[17]、LMP1相关mRNA[27]、基质金属蛋白酶13(MMP-13)[28]等。这些因子在传递病毒蛋白、参与细胞转移、调控肿瘤演化发展以及免疫调节等方面发挥了重要的作用,相互作用,共同推动了NPC的恶性进展[21]。

外泌体与口腔鳞癌口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)发病率占头颈部恶性肿瘤的24%[29],淋巴结转移是导致患者五年生存率较低的主要因素。而肿瘤来源的外泌体被认为肿瘤细胞与肿瘤微环境进行交流的重要方式,并参与到细胞增殖转移、迁移浸润等一系列影响之中[30-31]。

外泌体miRNA与口腔鳞癌 Sakha等[32]发现高度转移的OSCC细胞株HOC313-LM来源的外泌体可通过激活ERK和AKT信号通路诱导细胞增殖,并发现外泌体中高表达的miRNA-1246通过直接靶向DENND2D基因(DENN/MADD domain containing 2D)增强了转移性较差的细胞株HOC313-P的细胞迁移能力。Li等[33]通过miRNA测序发现不同氧浓度条件下OSCC外泌体差异miRNA之中,miRNA-21的表达水平差异最为显著,并发现外泌体miRNA-21在降低细胞E-钙黏蛋白表达的同时显著增加了Snail和波形蛋白的表达水平。这些研究提示外泌体特异性miRNA在口腔鳞癌细胞迁移以及上皮间质转化中具有重要作用,有可能与肿瘤转移密切相关。

Dickman等[34]通过RT-qPCR技术发现在OSCC外泌体中miRNA-142-3p的表达水平明显高于细胞内。当细胞内miRNA-142-3p的浓度升高时,通过靶向作用于转化生长因子-β受体1(transforming growth factor-beta receptor 1,TGFBR1)下调细胞内TGFBR1的表达水平使得诸如克隆形成、增殖生长等恶性表征减弱。这提示miRNA在细胞和外泌体内表达水平不同,miRNA分拣进入外泌体是具有特异性的,即肿瘤细胞将具有恶性特征的miRNA分拣进入外泌体,然后传递给其他肿瘤细胞以及基质细胞等从而影响和改变肿瘤细胞的一系列恶性行为。

其他 据既往研究[35-36]证实,肿瘤细胞摄取和内化外泌体取决于细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (heparin sulfate proteoglycans,HSPGs),而肝素可以竞争性结合HSPGs的共受体。Sento等[37]通过肝素处理OSCC后发现,肝素可通过阻断肿瘤细胞与外泌体的融合内化,阻断外泌体对肿瘤细胞增殖分化等影响,这也为临床治疗OSCC提供了一个新的思路。

外泌体与舌癌尽管目前手术和放化疗水平的进展迅速,但舌癌患者仍然具有高居不下的转移率和死亡率[38],舌癌细胞来源的外泌体在其中占有重要的地位。

外泌体CAV1与舌癌 小窝蛋白1(caveolin-1,CAV1)在多种类型的细胞中均有表达[39],文献[40]报道CAV1在介导肿瘤细胞增殖、侵袭等恶性行为方面具有重要作用。Vered等[41]发现,舌鳞癌细胞株HSC-3能产生富含CAV1的外泌体,能将CAV1通过外泌体运输的形式从肿瘤细胞横向转移至肿瘤微环境中。这说明含有CAV1的外泌体在舌鳞癌发生发展中可能具有重要的作用。

外泌体蛋白质与舌癌 有研究者[42]通过研究舌鳞癌Tca8113细胞和正常口腔黏膜细胞外泌体之间的蛋白组学表达差异,发现肿瘤拒绝抗原1(gp96)和纤维母细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)蛋白具有最显著的差异。目前研究[43]证实,gp96参与抗原递呈过程,在抗肿瘤特异性免疫反应中具有重要作用,推测肿瘤细胞可能通过产生富含gp96的外泌体排除自身抗原,从而逃避免疫监视;而FGFR2在口腔鳞癌[44]和胃癌、直肠癌[45]等肿瘤中均存在表达,在肿瘤的发生发展和演化中具有重要的促进作用。

其他 廖贵清等[46]较先从舌鳞癌细胞株Tca8113培养上清液中分离纯化外泌体,并通过体外抗瘤试验表明,负载外泌体的树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)对Tca8113细胞的杀伤率明显强于未负载外泌体的对照组。提示外泌体在抗原递呈等肿瘤免疫领域具有很强的应用前景,有望形成新型的肿瘤疫苗。

外泌体与喉癌目前外泌体在喉癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)研究中的报道相对较少。Wang等[47]通过研究发现,LSCC患者血清中外泌体miRNA-21和HOTAIR的表达水平与患者临床分级、T分期以及淋巴结转移密切相关,更重要的是通过miRNA-21和HOTAIR的联合检验能够筛查可能罹患LSCC的患者,具有较高的敏感性和特异性。这预示着miRNA-21和HOTAIR的联合检验可以作为潜在的LSCC患者诊断的标志物以及预后评价的指标之一。外泌体与LSCC之间的联系有待于进行更多的基础及临床研究来揭示。

结语头颈部恶性肿瘤作为全球第六大恶性肿瘤,较高的发病率及较差的预后一直以来制约着患者的生活水平和寿命[48]。虽然发现外泌体的时间不长,但外泌体在头颈部恶性肿瘤以及其他肿瘤中潜在的研究价值却越来越受到关注。外泌体内各种“货物”通过细胞间物质交换、传递参与了头颈部恶性肿瘤的增殖迁移、耐药转移以及免疫调节等各个生物学过程,推动了肿瘤的恶性发展,这有助于更加深刻地认识头颈部恶性肿瘤发生发展的内在机制。与此同时,研究者们一直致力于筛选头颈部恶性肿瘤患者血清等体液中存在的外泌体作为合理稳定的生物标志物以期能进行早期筛查、靶向治疗和预后判断等方面。

尽管外泌体在头颈部恶性肿瘤中的研究日益丰富,但是仍然存在许多问题亟待解决。就外泌体本身而言,外泌体是否依据其形态和功能具有更细致的分类是摆在众多研究者面前的重要问题[49];外泌体被细胞摄取后外泌体内的成分是否一定能够发挥作用也值得我们进一步探寻[50]。而在头颈部恶性肿瘤的诊治方面,外泌体作为生物标志物在特异性、敏感性、稳定性和临床适用性等方面是否优于传统的血清标志物;利用外泌体作为头颈部恶性肿瘤化疗药物载体给药是否存在抗原性以及毒性等问题都有待论证。这些问题都值得我们进一步探索外泌体以及外泌体在头颈部恶性肿瘤中的作用。