高通量测序在尸体微生物及死亡时间推断中的应用

符晓亮 ，郭娟娟 ，刘卓鹰，沈 肖 ，蔡继峰

（1.中南大学基础医学院法医学系，湖南 长沙 410013；2.拉萨市柳梧新通站拉萨铁路公安处，西藏 拉萨850000）

法医微生物学（forensic microbiology）通过各种微生物学分析方法推测特定微生物的来源、亲缘关系或传播途径，针对生物恐怖袭击与生物犯罪，为追踪犯罪实施者提供科学依据[1]。同时，通过探索尸体腐败过程中腐生生物的菌群结构及其演替规律，法医微生物学也可为死亡时间（postmortem interval，PMI）推断提供依据。PMI是指死后所经历的时间，即发现、检查尸体距死亡发生的时间间隔[2]，准确推断PMI，在划定侦查范围、提供侦查线索、确定犯罪嫌疑人有无作案时间、阐明作案过程及案件性质等方面均有重要意义。目前，通过尸冷、胃内容物及法医昆虫学等方法可较为准确地判断一定范围内的PMI，然而，影响尸体腐败的环境因素极为复杂，在检案过程中，仍需将多种推断方法结合实际案情才能获得较为可信的PMI。寻求多元线性的PMI推断指标仍是当前法医学研究的重点和难点。

1 当前PMI研究热点

传统的PMI推断方法主要依赖于死后尸冷、尸斑、尸僵等尸体现象的观察[3-5]，仅通过主观经验的判断，无法对死后尸体现象进行综合性定量分析，尤其在腐败晚期，尸体现象难以辨认，使PMI的推断更为困难。探索新的PMI推断方法，已不只是法医学者的研究方向，同时也得到了医学物理学、生物化学、分子生物学、昆虫学、微生物学等多学科研究者的关注。例如，近年来，有关研究利用体液（脑脊液、心包液、玻璃体液等）中生物化学成分的变化来推断PMI[6-9]，尤以运用玻璃体液中钾离子浓度的报道[10-11]较多。玻璃体因巩膜等解剖结构对其内容物的保护，在腐败早期不易受到外界污染及影响，因此，玻璃体内容物因其状态较为稳定，可作为研究PMI较好的指标。目前研究[12]结果表明，玻璃体液中钾离子浓度与早期PMI之间有较好的相关性。DING等[13]已建立玻璃体液钾离子浓度的荧光检测方法，从而快速推断PMI。而对于更晚期的PMI，不论是玻璃体还是心包、血脑屏障等，其解剖结构依然会受到腐败破坏，体液样本将难以采集，对推断干扰较大。

法医昆虫学（forensic entomology）作为一门特色鲜明的交叉性学科，通过对尸体内、外或附近环境采集到的昆虫标本进行检验、鉴定、分类，明确昆虫种类和地理分布、确定生长发育状态，结合昆虫在尸体上的群落演替规律推断PMI[14]。虽然该方法已有效地用于实际检案[15]，但受到昆虫地理分布的差异，其推广应用还需要大量昆虫学资料的积累。另外，不论在科学研究还是实际检案中，培养更多专业的法医昆虫学者来对采集到的昆虫标本进行鉴定、分类是必不可少的。

小分子遗传物质DNA[16-17]或RNA[18]相对于生物大分子而言更易于检测，并具有较高的特异性。其降解与腐败相关，LV等[19]研究发现，99%的小分子遗传物质随PMI进展呈下降趋势。目前，国内外研究较多的有 18S rRNA、β-actin mRNA、microRNA[20-22]等。 而在尸体腐败的过程中，微生物的繁殖也会产生大量DNA和RNA，并且微生物的代谢会引起这些遗传物质数量的改变，无论对于血液还是组织样本均会产生较大影响。寻找组织特异性更高的遗传序列的研究仍在进行中，利用遗传物质推断腐败尸体PMI有待进一步验证。

此外，还有通过气质联用技术检测死后尸体代谢产物改变（0～48 h）[23-24]、基于磁共振波谱学分析不同PMI尸体光谱差异（0～10 h）[25]、利用扫描电镜检测关节软骨晶体变化（3～6周）[26]以及监测腐败过程中尸体组织生物力学指标改变（2～230 h）[27]等多学科交叉性研究，这些研究基于尸体本身物质的降解或物理性改变，利用现代方法更深入地探索了尸体的微观改变，具有重要的法医学意义。

2 法医微生物学在PMI研究中的应用

腐败是最重要的死后现象，无论尸体结构还是物质组成均会发生巨大改变。法医微生物学从尸体腐败本质入手，探索腐败过程中微生物的演替规律，挖掘微生物菌群结构及代谢改变，分析优势菌群相对丰度变化等，为PMI的推断提供了新的突破口[28]。HEIMESAAT等[29]使用培养法、生物化学及免疫组织化学等方法分析了大鼠肠道菌群改变，发现肠球菌数量在死后72h内增加了2～3倍。LIU等[30]通过生物发光快速检测法检测尸体微生物ATP含量，发现在大鼠肌肉、肝、脾、肾中，微生物的腐败代谢作用使ATP含量发生改变，其规律性与PMI显著相关。PECHAL等[31-32]使用Biolog-Eco微平板分析尸体菌群对不同碳源的代谢差异，发现死后尸体微生物在春季、夏季及冬季代谢率增加，而秋季降低，同时，在有昆虫参与的腐败过程中代谢率更高，基于Biolog-Eco微平板的尸体微生物代谢分析可为死后0～240 h的PMI推断提供参考。HAUTHER等[33]通过实时荧光定量PCR对拟杆菌属（Bacteroides）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）细菌进行定量分析，发现其相对丰度随PMI的延长呈下降趋势。

目前，各学科利用现代技术方法对尸体菌群进行了研究[8，29-30，32]，然而，在尸体腐败过程中挖掘微生物的变化规律，其数据的积累依赖于在不同环境中重复大量尸体实验以及对腐败过程中尸体腐败菌群整体动态变化的系统分析。传统的培养法在微生物学研究中仅能进行半定量分析，并且大量的未知菌种尚无法进行人工培养，在尸体微生物的研究中覆盖面较窄。腐败过程中微生物的代谢规律也极为复杂，仅探索个别代谢通路不足以支撑对整个腐败过程的了解。通过实时荧光定量PCR等技术可检测腐败过程中某一种微生物的丰度变化，然而，实际案例中尸体所处环境复杂，腐败菌群多样性极高，仅对一种或几种细菌丰度变化的了解难以解释菌群的整体改变。随着高通量测序（high-throughput sequencing，HTS）技术的成熟与发展，不同环境中的微生物多样性被逐一解读，大样本量、高通量的测序可对复杂环境下的微生物变化进行系统而动态的分析，甚至使人们重新认识和定义不同的微生物群落。在法医学界，尸体微生物季节性变化[34]、特定腐败时期尸体菌群结构的变化[35]、水中或陆地尸体微生物多样性研究[36-37]以及尸体骨骼、肠道等器官微生物差异[38-39]等研究，通过使用动物尸体进行实验，或采集实际案例中人尸体微生物样本进行HTS分析，测定细菌、真菌等微生物特异性标志物，挖掘不同条件下腐败过程中微生物种类及丰度差异，分析微生物群落多样性信息，在法医微生物学上取得了重要成果。例如，CARTER等[34]发现不同季节（冬、夏季）中尸体下方土壤菌群结构差异显著，而HYDE等[35]明确同一尸体不同腐败时期（肿胀期前、后）菌群结构差异同样显著。HYDE等[37]同时发现陆地尸体上，蝇类相关菌属（Ignatzschineria和Wohlfahrtimonas）和土壤相关菌属（Acinetobacter）常见，而 KAKIZAKI等[36]发现水中尸体血液和器官中含有大量蓝藻细菌和硅藻，水源性的菌种在内脏器官的出现还可成为生前溺死的证据。DEBRUYN等[39]发现，随PMI推移，肠道菌群丰度增加，多样性降低，而DAMANN等[38]发现干化期骨骼菌群含有部分肠道菌群，可推断较晚期的PMI。不少研究机构在“尸体农场”直接利用人尸体进行实验，同时对腐败微生物、嗜尸性昆虫及尸体内源性物质进行系统化研究，取得了PMI推断突破性进展[40]，这些研究均采用了HTS技术来探索腐败菌群的动态变化。近年来，随着HTS的普及和测序成本下降，也使研究者从宏观角度对大样本量的尸体微生物进行生物信息学统计分析成为可能。HTS可直接对一个微生物物种或群落的转录组和基因组全貌进行精确分析，因此，对于尸体微生物演替规律的探索，HTS是目前最为全面、快速的技术方法之一。相对于传统的生物化学鉴定法，HTS技术不需要对微生物进行人工培养，而是直接对环境样本中的16S、18S、内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）等特定核苷酸序列扩增，进而同时对上百万扩增序列进行测定，达到鉴定环境样本中全部微生物种类及丰度的目的[41]，满足对尸体腐败过程中细菌、真菌以及其他真核微生物群落结构的全面认识。

3 HTS在人体微生物组计划中的应用及其对尸体微生物研究的启示

尸体微生物HTS最早受人体微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP）启发，同时，HMP的测序数据对死后尸体初始菌群的探索具有重要参考价值。美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）在 2007年启动了 HMP，该计划是人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）的延伸，其用5年时间耗资1.5亿美元完成900个人体微生物基因组测序，目标是研究人体微生物组变化与人体健康和疾病的关系，同时也可为其他学科提供人体微生物学数据信息和技术支持[42]。HMP推动了HTS技术在微生态研究中的发展，随着454、Solexa、SOLiD、Illumina MiSeq、Hiseq等测序平台的成熟和普及[43]，各研究机构和测序公司专业化的测序服务与数据分析已全面覆盖各种环境微生物的样本分析，这也给法医微生物学研究提供了极大便利。

人体中的微生物细胞数量可能达到1014量级，超过人体细胞数目的10倍以上，其编码的基因数量可达人类基因组基因数量的100倍以上[44]。随着HMP研究的进展，研究者逐次诠释了胃肠道[44]、泌尿生殖道[45]、口腔[46]、眼部[47]、鼻咽部[48]、皮肤[49]等部位的微生物群落多样性。例如，在结肠中的微生物区系存在有800～1 000个种类，其中62%的种类为过去所未知，80%的种类无法通过现有的培养方法进行培养[50]，这也足以显示HTS技术将在探索人类未知微生物领域所带来的巨大帮助。通过与自然环境中微生物的测序数据比较发现，人体的微生物种类仅为自然界微生物中很少的一部分，在自然界70多种细菌门类中，只有9个细菌门在人体肠道内发现，并且仅厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）在肠道菌群中占主导地位[51]。与人类基因组不同的是，人体微生物宏基因组结构因年龄、饮食习惯等因素而有着巨大的差异[48]。目前，不同个体间是否存在相同的核心群落，菌群在人体分布是否随机等问题尚存在争议[51]。即使在胃肠道的不同段位，微生物群落结构也极为不同，例如，盲肠以兼性厌氧菌为主，而末端结肠却以专性厌氧菌为主[52-53]。这些微生物在人体死亡后即为尸体的初始菌群，其是否参与尸体的腐败进程，与环境菌群比较，谁将会在腐败过程中扮演主要角色，人体本身微生物群落的差异是否会影响PMI推断的精确性，这些均是法医微生物学必须解决的关键。通过HTS在HMP中的应用，我们全面了解了人体微生物群落的复杂性。而在死亡发生后，免疫及屏障功能消失，人体及环境间的生态位将相互交融，持续而动态改变的人体微生物群落将发生怎样的演替，也可通过HTS进一步探究。

4 HTS对尸体微生物菌群结构的探索

自然环境中微生物几乎无处不在，无论是活体还是尸体，微生物均会形成种类庞大而复杂的群落。在腐败过程中，尸体微生物的群落结构会发生极大的改变，而这种时序性变化可作为一种“生物计时器”，为PMI的推断提供依据[54]。过去数十年，微生物学家利用培养法[29]、微平板分析法[31-32]、磷脂脂肪酸法[55]等了解环境微生物结构，这些方法或代价较高，或消耗大量时间成本。而HTS技术大规模用于HMP和地球微生物组计划（Earth Microbiome Project，EMP）[48，56]，使我们能从分类学角度更为真实地了解自然界微生物群落多样性信息，同时也为法医学者将腐生微生物、土壤微生物等应用于法医学相关问题提供了有效解决途径。

陆地尸体的腐败可分为新鲜期、肿胀期、高度腐败期、后腐败期以及残骸期[57]。新鲜期为死亡至尸体开始肿胀的阶段，此时蝇类开始进入尸体，而尸体的肿胀即是体内腐败细菌代谢活动所产生的气体造成，尸体释放大量腐败气体，吸引了大批不同种类嗜尸性昆虫的到来和繁殖[58]。随着昆虫和微生物对尸体的共同侵蚀，腐败期尸体组织被快速腐解消融[59]。在后腐败期，随着尸体有机质的消耗，蝇类不复存在，皮蠹和黑水虻类是此阶段的主要昆虫[60]，而微生物群落结构仍发生着较大的改变[61]，尸体呈现高度腐败状态，尸僵、尸斑、角膜混浊等尸体现象难以辨认。最后随着组织水分的丧失，尸体进入残骸期，仅存骨骼、干化的皮肤以及毛发等残骸。此时，螨虫是尸体上的主要节肢动物，不论是骨骼还是皮肤均可由真菌形成霉斑，甚至是霉尸[62]。由此可见，微生物的代谢作用贯穿了尸体腐败的整个过程，并在腐解过程中扮演着重要角色。

HTS的优势在于可直接对尸体上的微生物群落进行测序，获得样本全部物种分类和丰度信息，并从生物信息学角度挖掘腐生微生物区系变化与PMI之间的相关性，从而解决腐败尸体PMI推断的难题。PECHAL等[31]利用多组猪尸体模型进行测序研究，发现无论在某一季节还是不同季节间，尸体微生物群落均发生着演替改变，同时该研究也初步证实由微生物群落演替所带来的遗传标志物数量的改变，可用于PMI的评估。HYDE等[35]通过HTS进一步证实，在腐败过程中人尸体不同部位的微生物群落均是从厌氧菌向需氧菌的转变。该研究结果同时也表明，与HMP在健康人体的研究结论类似，不同尸体、尸体的不同部位以及不同时间点，微生物群落均存在着巨大差异。PECHAL等[63]通过HTS证实，在腐败过程中微生物门、科的数量随PMI存在负向线性关系。METCALF等[54]利用大鼠为尸体模型，通过HTS诠释了尸体与其土壤间的相关性，确定了6个出现在尸体下方土壤的菌门，并构建预测模型，推断PMI误差在3 d以内。在国内，GUO等[61]也利用HTS探索了大鼠口腔、肛门内细菌在各腐败阶段的群落结构，并比较了昆虫对腐败进程的影响，测序结果表明，尸体口腔、直肠初始菌群差异较大，而随着腐败进展，各部位菌群结构趋于相似，同时发现，昆虫会加快腐败进程，但对尸体菌群的演替影响较小。

随着基于HTS的尸体腐败过程研究的开展，人们对尸体腐败分期及腐败现象也有了更深入的认识。在尸体肿胀期，肠道内源性厌氧菌，如厚壁菌门的乳杆菌科以及拟杆菌门的拟杆菌科在死亡发生后进入腹腔并大量增殖，产生含有烃类、有机胺类、氨类的气体，成为造成尸体肿胀的主要因素[64]。而尸体的进一步腐败和组织消融，则由肠源性微生物和经血液、淋巴液传播的微生物共同造成。尸体体表的破溃使得叶杆菌、生丝微菌、布鲁杆菌等需氧菌和兼性厌氧的菌肠杆菌等成为腐败的主力[65]。最终，环境中的真菌，如毛霉菌、白地霉、青霉菌等将转移至残存的尸体组织，形成霉斑、霉尸[62]。

5 HTS对尸体微生物研究的展望

尸体微生物不仅在PMI推断中有着重要作用，在微量物证、民族、国别甚至个体识别等法医学调查中也有着极为重要的价值[66]。虽然HTS对尸体微生物的探索有着巨大的潜力，但就目前的研究而言，其数据量还不足以建立普遍适用而精确的PMI推断方法。一方面，微生物本身种类繁多，微生物群落间相互作用关系复杂，在不同尸体及环境中也分布不一；另一方面，受伦理学约束，尚难以大规模开展人尸体实验，目前HTS测序数据多基于动物尸体实验。为提高数据积累效应，尸体微生物实验、样本的采集、DNA提取方法以及环境数据的记录等标准需统一，以排除不同的操作者或操作方法等因素带来的误差，使每一个样本都能客观、真实地反映尸体微生物菌群结构，最终才能综合各条件下的尸体实验数据进行比较分析。在微生物样本的采集中，采集同一尸体不同时间点的微生物样本，应尽可能避免每次采集同一位点的样本，以减少采样对尸体菌群演替的影响；在采集尸体内部微生物时，直接使用拭子进行采集将破坏尸表的连续性，混淆尸体内外菌群，干扰尸体的自然腐败过程。因此，采用无菌注射器对胸、腹腔注射并抽吸生理盐水更有利于尸体内部菌群的研究。再如，在尸体实验的同时采集环境微生物样本，与腐生微生物种类形成对照，可减小环境因素对实验数据分析的影响。HTS可重现大量无法通过培养法获得的菌种。因此，在DNA提取方面对样本的浓度、纯度均有较高要求，获得高质量的宏基因组DNA样本是尸体微生物研究所必需的。而尸体腐败过程中产生的腐殖酸等有机酸对DNA提取以及后期PCR扩增都有着不良影响，目前一些商业化的试剂盒已能较好地去除这类腐败物质，但是样本采集之后，微生物的保存、转运等步骤仍会对最终数据结论产生影响。另外，利用HTS对尸体微生物的探索不仅仅局限于群落的演替规律，进一步在宏基因组、宏转录组水平对尸体微生物的探索，可揭示其参与腐败的代谢机制，明确其代谢过程中的优势功能、代谢标志，探索环境因素对尸体腐败的影响、环境菌群与尸体菌群间的相互作用关系以及尸体腐败对环境所造成的改变，不仅可用于PMI推断，对案发地点、落水区域、抛尸时间、埋葬时间以及尸体转移情况等具有重要参考价值。

综上所述，相对于HMP，尸体微生物的探索将更为复杂与艰巨。尸体腐败是人体与环境两大微生物群落的共同作用，HTS的发展给法医学者研究尸体微生物带来了新的研究方法，统一和标准化的尸体实验及样本采集方法将更有利于我们全面了解腐败微生物菌群结构。面对大量的测序数据，深层次的生物信息学比较分析也有助于我们对尸体微生物演替规律的掌握。对不同环境、不同条件下的尸体腐败有待利用HTS进一步探究，类似于HMP、EMP，我们同样期待与尸体腐败相关的微生物组计划抑或“尸体微生物组计划”的诞生。