死亡时间推断最新研究与展望

王 琪 ，林汉成 ，徐纪茹 ，黄 平 ，王振原

（1.重庆医科大学基础医学院法医学教研室，重庆 400016；2.西安交通大学医学部法医学院，陕西 西安710061；3.西安交通大学医学部基础医学院，陕西 西安 710061；4.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

死亡时间（postmortem interval，PMI）通常指的是死亡发生时至尸体被发现时的时间跨度，也可以称为死后间隔时间或死后经历时间[1]。相对准确地推断PMI对确定侦查方向、确认或排除犯罪嫌疑人、估计案发时间等犯罪现场重建有着重要的意义。此外，PMI推断在某些民事纠纷，如保险理赔、财产纠纷等案件中也扮演着极其重要的角色。PMI推断一直是法医学研究和实践工作中的重点和难点。由于传统推断PMI的方法存在诸多限制，多年来国内外法庭科学学者尝试了不同的技术方法，研究了机体死后不同观测指标的时序性变化，并取得了可喜的研究进展。

1 传统推断PMI的技术手段

1.1 形态学

早在三、四世纪，古希腊和古埃及的学者们便已发现尸僵这一尸体现象可用于PMI估计[2]。直至今日的法医病理学工作实践中，尸体现象仍是推断PMI最常用的手段之一。此外，其他早期尸体现象（如尸斑、角膜改变）、晚期尸体现象（如尸绿、腐败水泡）、胃肠内容物消化程度、膀胱尿量等也可作为补充方法用于PMI推断[1]。对这些传统方法也有部分改良性研究，如YOSUKE等[3]利用分光光度计法研究成人死后72h内尸斑的颜色变化趋势，其推断PMI的误差为6.95 h。MEGYESI等[4]提出尸体综合评分（total body score，TBS）系统法来进行PMI推断，该评分系统包括尸体现象及其他等十几个评价指标，根据每个指标出现的位置、严重程度和蔓延范围给出相应的分数，最后统计出总分并给出相应的PMI。该PMI推断评分法使得早晚期PMI推断得以量化，一定程度上减小了人为主观因素的干扰。

1855年，BERGERET首次将昆虫学的发现和PMI推断联系起来，这是现代法医昆虫学的萌芽[5]。随后，大量学者开始运用法庭昆虫学的成果和技术进行PMI推断的相关研究。但是到目前为止，经典的法医昆虫学的论著书籍并不多，主要描述嗜尸性蝇类、节肢动物、甲虫和螨等物种的生物学特性，死后不同阶段昆虫的入侵规律，蝇卵及其孵化幼虫在尸体的动态发育规律以及个体生态学的研究[6]。其中，利用嗜尸性昆虫的发育或演替规律来推断PMI是法医昆虫学家们研究的重点[5]，但昆虫学的方法主要还是适用于晚期PMI的推断，而且部分方法主观性强、技术门槛要求高，同时由于昆虫的分布和习性问题，许多实用结果仅适用于特定的地区或季节。

1.2 物理化学

随着PMI的延长，尸体各项物理和化学指标也会随之发生变化。通过相关的手段检测这些指标变化，可以用来大致推断PMI。最值得一提的是，机体死后能量代谢停止，尸体会向周围环境逐渐释放热量直至降至环境温度，这一过程被称为尸冷。分析和建立尸冷数学模型可用于PMI推断[1]，但实际应用中不难发现，一旦尸体温度降至室温，尸冷现象便不再发生，所以该方法并不适于晚期PMI的推断。另外，由于各种内外界因素的影响，采用单一计算公式或数学模型推断出的PMI结果的误差可能很大，不同计算方法推断的结果也不一定相同。其他物理化学指标方面，薛冰等[7]利用γ射线照射技术测定小鼠死后不同时间点各组织的γ射线吸收值，发现死后PMI和小鼠对γ射线吸收规律有着显著相关性。HASEGAWA等[8]用计算机体层摄影（computerized tomography，CT）评估死后脑电图的改变，发现脑脊液中的早期纵向放射强度变化可以作为PMI推断的潜在指标。KOOPMANSCHAP等[9]在对死后CT扫描的研究中也发现，脑脊液和玻璃体液的死后CT密度值与PMI有显著相关性。ISHIKAWA等[10]观测140例死者的CT信息，发现死后CT成像中的主动脉狭窄具有时序性变化规律。BILHEUX等[11]利用中子射线照相检测狗尸体模型的氢丰度变化，结果发现，中子透射率的增加可能与组织中氢含量的减少有关，进而与PMI相关。MARÍN-ROLDAN等[12]利用激光诱导击穿光谱（laser-induced breakdown spectroscopy，LIBS）检测猪骨骼肌样本中 Hα、Na、Mg和K的发射强度比值来推断PMI。有学者[13-19]应用电阻抗技术测定机体死后组织的电阻值、电导率及氧化还原电位值进行PMI推断，揭示了电化学相关方法在PMI推断方面的潜在价值。STERZIK等[20]应用反射光谱技术测定195名死者尸体右下腹皮肤的反射变化，随着PMI的延长，反射光谱也随之发生规律性变化。另外，也有学者[21-25]通过检测不同器官的最大应力、极限载荷等生物力学参数的时序性改变来推断PMI。ROMANELLI等[26]用相差显微技术观察死者鼻黏膜涂片内的纤毛运动频率，发现该指标随着PMI的延长不断降低。杨天潼等[27]利用单体素氢质子磁共振波谱技术测定家兔死后脑组织中N-乙酰天门冬氨酸、胆碱复合物及磷酸肌酸和肌酸峰下面积，并构建了相应的PMI推断回归方程。

1.3 生物化学

国内外许多法庭科学学者对尸体组织和体液中的生化指标进行了检测，发现一些生化指标具有较好的死后时序性变化规律，可用于PMI推断：（1）蛋白质作为生物组织重要组成成分，在生物体中的分布非常广泛。先后有学者[28-39]使用免疫组织化学法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法和蛋白质印迹法对死后人体和动物组织内多种蛋白质进行检测，发现蛋白质具有一定的死后时序性变化规律，且不同种类蛋白质的稳定性和降解速率均互不相同。（2）DNA作为生物体的遗传物质，同样在机体死后的一段时间内会发生降解。一些学者[40-41]采用Feulgen-Vans染色、细胞学涂片和流式细胞仪等技术系统研究了机体死后DNA降解规律，结果表明，DNA降解与PMI显著相关，且环境温度对DNA的降解具有显著影响。此外，也有学者[42-43]利用单细胞凝胶电泳技术检测到细胞内核酸酶会在机体死后逐渐降解染色体DNA，并且随着PMI的延长，DNA的碎裂程度逐渐增加。（3）与DNA相比，RNA更不稳定，随着研究的不断深入，生物体内和外环境中广泛存在的RNA酶类物质在推断PMI方面的潜力正在逐渐被学者们所挖掘。一些学者[44-52]利用反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）技术研究了死后人体血液、牙髓、小鼠胸腹部器官和肌肉组织的RNA降解变化规律，其研究结果表明，RNA降解与PMI显著相关。另外，也有学者[53-54]发现某些mRNA或miRNA表达水平具有“生物钟现象”，与昼夜节律明显相关，也能在一定程度上辅助推断PMI。（4）除了蛋白质和核酸等生物大分子，学者们还对死后不同组织或体液中各类物质或离子的变化情况做了一定研究，目前主要关注的是玻璃体液内钾离子的浓度变化情况，但是不同学者建立的推断PMI模型不尽相同，推断结果也存在一定的差异，给实际应用带来了一定的困难[1]。另外，大量的研究[55-69]表明，ATP、柠檬酸盐、神经递质及其分解产物、氨基酸、糖原、葡萄糖、甲酸、还原型辅酶Ⅰ、尿酸、次黄嘌呤、乳酸、肌酐、尿素氮、重金属、挥发性有机物等物质的含量也存在死后时序性变化。

1.4 振动光谱学技术

振动光谱学技术主要包括红外光谱和拉曼光谱技术，是一类新型的分析技术，具有操作方便、样本无破坏性、仪器设备造价相对较低等优点[70]。该技术也赢得了国内外法庭科学学者的青睐，其在微量物证、法医人类学和法医学等方面的研究与应用也与日俱增[71]。

红外光谱技术应用于PMI推断已早有报道。例如，黎世莹等[72]利用红外光谱技术观察窒息死大鼠肝、脾、心肌、骨骼肌组织的光谱变化规律，证实了不同区域的吸收峰峰强比值随大鼠PMI的延长呈现不同的变化趋势，其中肝脾组织峰强比与PMI的相关系数较高。HUANG等[73-79]采用红外光谱技术采集了不同环境温度影响下，大鼠、家兔等不同组织器官死后不同PMI的红外光谱，运用不同吸收峰的峰强比或峰面积指标结合传统的数学建模方法进行回归模型的拟合，可较好地推断PMI。同时，也有其他学者[80-81]对不同实验动物不同组织进行类似的研究报道。然而，早期利用单一或几个吸收峰信息进行数学建模的方法较为简单，不能充分利用宏量的光谱数据，也易发生过拟合而致使模型在进行外部验证时不能取得满意效果。而后续更先进的化学计量学分析方法的引入，使所获得的PMI推断模型更加稳健和准确。例如，WANG等[82]利用红外光谱技术分析了掩埋与暴露两种状态下人类颅骨在死后76～552 d的时序性变化，并运用遗传算法结合偏最小二乘回归法建立了能够较为准确推断骨骼降解时间的化学计量学模型。LIN等[83]利用红外光谱技术分析了室内外不同条件下人类血痕形成0～107 d的时序性变化并采用偏最小二乘回归法和判别分析法建立了能够较为准确推断血痕形成时间的化学计量学模型。此外，也有研究[84-87]利用红外光谱技术分析实验动物血浆、心包液、肝等组织的死后时序性变化并成功建立PMI推断的化学计量学模型。

拉曼光谱技术在PMI推断领域也有一定运用。例如，DOTY等[88]利用显微拉曼光谱技术分析了人类血痕形成0～7d的时序性变化。熊平等[89]采用显微拉曼光谱技术检测了人体死后离体肝和肾的时序性拉曼光谱变化，发现组织细胞中DNA含量的变化与PMI的关系，其结果显示相对峰强值I1094/I2923随着PMI的延长呈下降趋势，两者之间存在线性关系。

1.5 代谢组学、脂质组学及蛋白组学

随着色谱学和质谱学技术的发展，代谢组学、蛋白组学和脂质组学的研究逐渐兴起，国内外法庭科学学者也逐渐开始使用相关的技术和方法进行PMI推断研究。不同于传统单一参数或指标推断PMI的方法，代谢组学、脂质组学及蛋白组学技术主要使用多变量分析方法对死后不同代谢产物的整体轮廓进行分析，可以利用大量数据挖掘出更多有用的信息。

在代谢组学方面，KANG等[90]采用液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）检测了大鼠死后24 h和48 h肝组织的代谢物变化，并筛选出15种与PMI相关的标志物。DONALDSON等[91]利用气相层析-质谱联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）技术对大鼠血浆的代谢组学分析，发现随着PMI的推进，谷胱甘肽、γ-氨基丁酸等26种代谢物也随之增加。SATO等[92]采用同样的技术分析了大鼠血浆，利用筛选出的25种代谢指标建立了推断PMI的偏最小二乘回归模型。KASZYNSKI等[93]在SATO的研究基础之上，利用GC-MS技术对小鼠的血清和肌肉代谢物作了进一步研究，并提出多组分标志物的整合分析和个体数据集的叠加分析可有效减少PMI推断偏差。蔡山青等[94]同样利用GCMS技术，检测窒息死亡大鼠脾组织中代谢产物的死后变化情况，找到了17种具有死后时序性变化规律的代谢物，并建立了相关回归方程。

脂质组学方面，早在2001年，YAN等[95]研究了猪的尸蜡模型，发现尸蜡内的脂肪酸种类会随着PMI推进而发生变化。WOOD等[96]采用串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）的方法分析了人体死后骨骼肌内的脂质变化，发现其长链脂肪酸及磷脂含量随PMI的推进而减少。FRERE等[97]对嗜尸性昆虫的蛹壳角质层进行提取和分析，发现样本的新鲜程度对氢化物、脂肪酸乙酯类化合物有显著影响。

在蛋白组学方面，MACHAALANI等[98]利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术对大鼠脑部不同功能区进行了分析，并研究了死后不同时间点蛋白指纹图谱的变化趋势。LI等[99-100]利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术研究了死后组织中蛋白质组时序性变化规律，发现不同PMI分组中，质谱图在相对峰位、出峰数目以及相对峰强上均存在明显的差异。

1.6 基因组学和转录组学

应用遗传物质的特异性序列推断PMI也有着一定的应用前景，基因组学和转录组学的研究主要是为了寻找时序性降解最为规律的DNA或mRNA序列，从而建立相应推断PMI的数学模型。

HUNTER等[101]检测了小鼠和斑马鱼数百个上调基因的死后表达情况，利用基因计量法校准后挑选出1063个显著上调基因进行线性回归分析，确定基因的建模参数后进行相关运算，发现基因转录组较单个基因转录物而言，能够更好地推断PMI。FENG等[102]使用 mRNA 完整性系数（mRNA integrity number，mRIN）来直接评估全基因组和基因特异性mRNA的完整性，发现死后尸体组织中部分RNA碎片3′偏移对整体的表达谱有显著影响，还进一步验证了该方法能有效地识别不同mRNA降解水平的样本。FERREIRA等[103]研究发现，许多基因在相对较短的 PMI（7～14h）内的表达均有明显变化，14～24h之间转录组变化趋于稳定，通过对比死前和死后的血样，还发现mRNA的降解是经过死后持续调控的，而不是简单随机的。

1.7 死亡微生物组学

死亡微生物组是近年来出现的一个新概念，是指机体死后微生物群落演替的过程，涉及整个尸体内部和外部的数万亿微生物定植、增殖和死亡，导致随时间推移的群落组成的时空变化[104-105]。随着高通量测序技术的快速发展、人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP）不断深入，已有学者[105]提出可以将零散的人体死后微生物组研究逐渐扩展到人体死后微生物组计划（Human Postmortem Microbiome Project，HPMP）。HPMP主要致力于搜集与人体和（或）人的替代品分解相关的来源广泛的微生物群落丰度及多样性的数据。通过提高对死亡微生物的认识，解决与死亡方式和PMI相关的实际应用问题，并确立及标准化可操作方案。目前，有关死后微生物组的研究多采用非培养的方式，即直接对人[105-112]、大鼠[104，113]、小鼠[109，114]及猪[115-116]的尸体样本不同部位进行取样，之后采用DNA提取试剂盒或传统苯酚-氯仿法提取DNA，最后选取细菌16S rRNA基因的1～2个可变区扩增子进行454焦磷酸测序、Illumina MiSeq平台高通量测序、毛细管电泳测序来检测机体死亡后不同部位、不同时间、不同条件、不同环境等情况下细菌的构成、丰度及多样性。

上述研究结果均表明，机体死亡后微生物群落会出现可重复的、与环境及时间相关的动态变化，这种变化被证明可用于PMI推断。如CAN等[106]在研究人类尸体脾、肝、大脑、心和血液中的死亡微生物组时发现：同一具尸体中，不同器官的死亡微生物组很相似；不同尸体之间因PMI、死亡和（或）环境因素不同，死亡微生物组不尽相同；尸体中梭菌占优的组织器官的降解期更长。DICKSON等[115]发表了一项关于水生环境中死亡猪的头部被表面移动的细菌群落分解的研究，并提出将海洋细菌的集群化和继承演替作为推断PMI的新工具。HYDE等[108]应用454焦磷酸测序技术研究两具人类尸体的口腔、肱二头肌、躯干的细菌群落，发现两具尸体间、同一具尸体的不同部位间、同一部位两次取样时间点间的微生物群落组成都不一样，随PMI的延长所有部位样本的微生物群落，均从需氧细菌转变为厌氧细菌。GUO等[104]在对大鼠的研究中发现，在分解的过程中，变形菌门（主要是Gammaproteobacteria）是口腔和直肠的优势菌门，而口腔和直肠中的厚壁菌门和拟杆菌门则逐渐降低。METCALF等[114]研究了小鼠模型中微生物群落的变化趋势，发现死后微生物群落的演替过程不但是可测、可观察的，而且还是动态、可重复的，并指出根据微生物群落的演替变化制定的死后微生物时间钟可较为准确地推断晚期PMI。METCALF等[109]在这之后，又进一步研究了小鼠及人类尸体在不同土壤基质（沙漠、草地、森林）的分解过程，指出土壤类型不是参与分解微生物群落发展的主要影响因素。PECHAL等[116]研究了3具猪尸体，发现其皮肤和口腔细菌群落在死后5d的时间内遵循相对一致的变化规律。TUOMISTO等[112]应用细菌培养和实时定量PCR技术，研究死后人体器官中细菌相对丰度的时序性变化规律，结果发现，葡萄球菌、链球菌等丰度随着PMI延长呈显著上升趋势，可用于PMI推断。DAMANN等[110]对死后15具尸体骨骼样本进行研究分析，发现部分骨骼化石仍然保持着与人类肠道相关的细菌，而干燥骨骼的细菌组成则保持着与土壤群落相似的群落特征。HAUTHER等[111]对12例人类尸体的大肠菌群进行16S rRNA基因定量分析，并对其中6具尸体降解过程中的细菌群落的连续性变化模式进行量化研究，结果发现，拟杆菌属和乳酸菌属的相对丰度在死后9～20d具有良好的时序性变化规律。

上述研究结果表明，微生物群落数据可发展成为一个精准的“时钟”对PMI进行预估，这为法庭科学领域推断PMI提供了一种新的工具。

2 基于大数据智能推断PMI的机遇与展望

目前，精确推断PMI仍然是困扰国内外法医学界的重大疑难课题，主要因为PMI推断受到了很多体内外界因素的干扰，如环境因素、个体差异、死亡原因等因素，另一方面又因单一的检测技术手段仍无法全面反映死后机体的多种时序性变化规律。因此，未来的相关研究，或可从以下三个方面着手。

2.1 建立多因素参与下的PMI推断模型

近百余年以来，围绕PMI的推断鉴定，国内外法庭科学学者们从组织学、分子病理学、生物化学、病理生理学等方面做了大量探索研究工作，但研究所反映出的时序性变化也多局限于某个理想的环境条件或模型中，如恒温、恒湿、同等营养状况、死亡原因模型等。而实际命案现场复杂多变，影响因素诸多，每一种因素都可能单独影响PMI的推断，也可能存在着一定的联合作用效应。所以，多因素影响下PMI推断模型的建立将是未来研究的重点。

2.2 多方法、多指标联合应用推断PMI

机体死后所发生的多种时序性变化是一个有机的整体，相互制约也相互影响。而传统PMI推断指标相对单一且分散，以至于所发现的单个或单类指标的变化不足以对人体时序性变化状态提供更为精准的信息。因此，在命案现场对发生时间进行准确推断的方法手段仍需不断扩张、更新和优化。综上思考，未来关于推断PMI的研究，应该是多技术联合运用，各自发挥作用，共同解决这一法医病理学的难题。

2.3 人工智能算法

如上所述，随着PMI推断研究的不断深入，多影响因素的参与以及多方法、多指标的联合应用，势必会伴随海量数据的产生，尤其是多组学（光谱学）方法联用产生的数以百万甚至千万级的数据变量，若要从此海量数据中探索隐藏于其中有价值的信息，则必须借助先进的算法来实现。当前，人工智能算法依附于迅猛发展的计算机技术也日趋成熟，其强大的信息解析能力可以非常有效地对庞大复杂的数据进行有序分析。人工智能算法的计算过程通常由四个部分组成，即数据获取、特征提取、模型建立、预测分析。通过上述建模、验证和预测过程，可以有效地对研究对象进行判别和预测。目前，人工智能算法，如人工神经网络、深度学习、支持向量机、聚类分析、偏最小二乘法和最邻近距离等算法已大范围地拓展到生物医学和法庭科学研究领域，成为生物医学和法庭科学研究的强大工具，其在PMI推断的研究领域里，也有望提供重大的技术支撑。