丝素蛋白支架材料生物可控降解性的研究进展

王 进(综述) 夏 军(审校) 王思群 魏亦兵 陈飞雁 黄钢勇 陈 杰 石晶晟 赵广雷

(复旦大学附属华山医院骨科 上海 200040)

生物医学领域组织工程技术的发展为组织、器官的修复、再生提供了新的方向和手段[1-3]。为寻找合适的生物支架材料,学者们做了大量的尝试,包括金属、生物陶瓷和生物聚合物类材料。但是,金属材料的生物相容性及降解性仍存在问题;生物陶瓷类材料脆性高且降解速率不稳定,如羟基磷灰石、磷酸三钙等;而生物聚合物类材料机械性能较差,降解速度较快,如胶原、明胶和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid,PLGA)等,这些缺陷都极大地限制了其在生物组织工程领域的应用[4-5]。

丝素蛋白作为一种天然材料,具有良好的生物相容性和一定的机械强度[6],已广泛应用于生物医学领域,如手术缝线、药物缓释材料[7]。丝素蛋白作为各种组织工程支架材料[8-11],主要应用形式有水凝胶[12]、薄膜[13-14]、纳米纤维[15]及三维多孔支架[16]等。Fan等[17]先后在兔、猪体内应用丝素蛋白/骨髓间充质干细胞支架重建前交叉韧带获得成功,具有可靠的机械强度,能够满足实验动物日常的活动需求。这些研究结果在一定程度上体现了丝素蛋白作为组织支架材料的可行性。

生物支架材料除了需具备良好的生物相容性和一定的机械强度,可降解性也是一个不可忽视的要素。根据美国药典对于可吸收(缝线)生物材料的定义,可降解材料在体内60天后应失去大部分强度,故认为蚕丝缝线为不可降解材料[18],但越来越多的研究已经表明,丝素蛋白在体内具有可降解性。Cao等[19]研究发现丝素蛋白在体内可以降解且降解产物主要是可溶性的肽链和游离氨基酸,易于被机体代谢或吸收,对人体无毒性作用及其他不良反应。Wang等[20]通过将三维丝素蛋白支架植入实验小鼠体内,发现炎症相关因子(如TNF-α、INF-γ、IL-6和IL-4等)在mRNA水平表达量很低,几乎不可测,并且局限于丝素蛋白植入部位,虽然INF-γ的表达量在支架植入体内8周时有短暂的升高,但是在6个月时显著下降,说明机体对丝素蛋白支架的免疫反应是极其轻微并且局限的,Thurber等[21]的研究结论也与之相符合。于丹丹等[22]利用超声成像技术评估丝素蛋白在大鼠体内的降解情况,也发现丝素蛋白凝胶植入Wistar大鼠体内16周后其纵径、宽径、横径都有统计学意义上的减小,因此也认为丝素蛋白具有可降解性。但是,在组织工程中,理想状态下生物材料的降解速率应时刻与组织再生的速率相匹配[23],且可以人为地调控其降解速率,因此材料的可控降解性显得更为重要。目前研究的丝素蛋白主要来源于家蚕的蚕丝,其降解速率受到以下多种因素的影响,通过对下列因素的研究有望实现对丝素蛋白降解速率的可调控性。

分子结构蚕丝蛋白主要包括包裹在外周的丝胶蛋白和处于核心位置的丝素蛋白,其中丝胶蛋白约占25%,丝素蛋白约占75%,有研究证明丝胶蛋白是引起免疫排斥反应的主要成分。核心的丝素蛋白分子包含一条轻链(L链)和一条重链(H链),形成了SILK Ⅰ和SILK Ⅱ两种构型。SILKⅠ型结构呈曲柄型,主要由无规则的蜷曲和α螺旋构成,结构不稳定,易于分解;而SILK Ⅱ结构更稳定,主要由反向平行的β折叠结构组成,是丝素蛋白的基础构像[24]。丝素蛋白往往同时含有SILK Ⅰ和SILK Ⅱ两种构型,并且这两种构型的相对比例对其降解性有较大的影响,SILK Ⅱ所占比例越高,降解性越低。而两者的比例受到多种因素(如温度、化学试剂、pH等)的影响。黄训亭等[25]研究发现,将丝素蛋白多孔膜经过乙醇处理后,SILK Ⅱ结构所占比例升高,降解速率减慢;Hu等[26]发现,当提高丝素蛋白制备过程中水蒸气退火的温度(>40 ℃)时,丝素蛋白中SILK Ⅱ结构所占比例也随之增加,在相同的酶促环境下降解速率下降。改变冷却温度或用碳化二亚胺或乙醇进一步处理丝素蛋白,其β折叠结构增多,降解性下降。增加或减少丝素蛋白中SILK Ⅱ(β折叠)的含量可以改变其降解性。

形态自然状态下的丝素蛋白具有丰富的β-折叠结构,所以降解速率较慢,而经过人工处理的丝素蛋白支架材料包括水凝胶、丝素蛋白膜、多孔的海绵结构等,其结构中β-折叠结构比例减少,所以其更容易被降解。黄训亭等[25]的研究发现,由于天然蚕丝中丝素蛋白纤维分子链结构更为规整、SILK Ⅱ含量更高,而多孔丝素蛋白纤维膜规整性较差,因此天然的纤维结构比膜结构的降解速度更慢。若应用丝素蛋白作为组织工程的材料,由于各个组织结构特点的不同,需“因地制宜”选用不同形态的丝素蛋白支架材料,此时丝素蛋白在不同状态下的降解性也应值得关注。

三维孔径生物支架材料应为细胞提供附着、生长及增殖的场所。支架材料的微观结构,尤其是其能否最大程度模拟自然状态下骨基质的三维结构,对骨髓间充质干细胞等种子细胞的长入、增殖有重要的影响。千建峰等[27]通过观察不同孔径丝素蛋白支架在SD大鼠活体内不同时间点的降解,发现孔径大小与丝素蛋白材料降解有明显相关性,且孔径较大的丝素蛋白支架比孔径较小的降解速度快,提示可通过改变丝素蛋白支架的孔径,有效地干预其在生物体内的降解速率以匹配不同组织修复的要求。Wang等[20]也通过研究体内3D支架材料的降解,发现三维支架孔径越小,降解速率越低。但组织细胞的长入还与孔径大小密切相关。在临床应用丝素蛋白三维多孔支架时,不仅要考虑材料的强度和组织的长入情况,不同孔径材料的降解性也是一个重要的考虑因素。

丝素蛋白浓度有研究发现丝素蛋白溶液的浓度越高,所制成的支架材料的降解速率越慢。Wang等[20]研究发现,以六氟异丙醇为溶剂所制得的支架材料与水作为溶剂相比,所得材料中丝素蛋白的浓度较高,降解速率较慢。任何可能影响丝素蛋白溶液浓度的方法或处理都可能会改变材料的降解性,这也为丝素蛋白应用于组织工程领域,对其降解性的控制提供了可行的手段,值得进一步研究。

种植部位丝素蛋白作为骨修复支架材料,植入机体后其降解速率受周围微环境的影响较大。植入不同的动物、不同的部位,其生化环境、机械受力情况、免疫因素、局部的生物化学因素均可以改变降解速率[19],详细作用机制有待于进一步研究。

酶的降解丝素蛋白可以被多种蛋白酶(如α-胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧化酶等)催化降解成多肽链或游离氨基酸。丝素蛋白分为以β折叠为主的结晶区和以无规则结构为主的非结晶区,酶催化分解丝素蛋白的过程中会优先降解非结晶区[28]。Numata等[29]研究发现,由于蛋白酶ⅩⅣ能够作用于结晶区,而α-胰蛋白酶对结晶区无作用,只能作用于非结晶区,并且随着非结晶区的降解破坏,结晶区(β折叠)所占的比例逐渐增加,故其对丝素蛋白的降解作用明显小于前者。随着酶的浓度、作用时间及其与底物接触面积的增加,降解速率也随之增加。不同的酶具有不同的作用位点,因此其对丝素蛋白的降解作用也有差异。

γ射线γ射线又称丙种射线,波长极短、穿透性极高,医学领域常用其来杀死肿瘤细胞。金洹宇等[30]研究了不同辐射剂量的γ射线对丝素蛋白降解性的影响,在0～200 kG的照射范围内丝素蛋白膜的降解性随受照剂量的增大有所提高。Kojthung等[31]研究发现,随着γ射线辐射剂量的增加,丝素蛋白结构中SILK Ⅱ结构减少,酶降解速度随之加快。γ射线能使细胞内的DNA片段断裂,导致细胞坏死、突变,不能直接用于人体,但该研究为丝素蛋白降解性的间接控制提供了一个新的思路。

磁场Aliramaji等[32]将磁性纳米微粒(氧化铁)通过反向共沉淀法与丝素蛋白/壳聚糖整合制成复合磁性支架材料,在丝素蛋白/壳聚糖支架材料中添加磁性微粒(<2 wt% )后,对外部的磁场有敏感的应答且丝素蛋白/壳聚糖支架自身生物相容性及理化性质并没有显著改变,但细胞的吸附、增殖等生物学行为提高,复合材料的降解速率降低。因此,通过施加外部磁场,有望通过非侵入性的方法调节该复合材料的降解性,但磁性微粒对人体的毒性作用和不良反应、如何调整复合材料中磁性微粒的比重以及外部磁场强度、频率、持续时间等问题有待于进一步研究。

结语丝素蛋白作为组织工程领域研究的热门生物材料之一,其降解性受到多种因素的影响,这些影响因素也是调节控制丝素蛋白降解速率的重要手段。虽然目前对于丝素蛋白材料可控降解性的临床研究报道较少,但上述研究都提供了新的方向和思路。