肝豆状核变性的分子诊断与治疗

程楠 韩咏竹

肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD）又称Wilson病（Wilson's disease，WD），是一种主要累及肝脏和大脑基底神经节的常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病，血清铜蓝蛋白减低、24 h尿铜和肝铜含量增高是其主要生化改变［1］。包括笔者在内的多项WD流行病学研究表明，中国人WD的患病率明显高于欧美人群，尤应受到临床医师的关注和重视［2⁃3］。

作为可治性神经遗传病，早期诊断和及时干预治疗对WD的病情和预后至关重要。由于WD患者与杂合子之间的铜代谢检查结果存在部分重叠，在判断WD家系成员和临床表现不典型的WD疑诊患者是否患病抑或是杂合子时存在困难，而基因诊断有着不可比拟的价值，其重要性日益凸显，与之相关的基因治疗研究也方兴未艾［4⁃6］。现根据文献将应用于WD分子诊断的各种基因诊断方法、适应范围及近年来基因治疗的研究进展进行简要概括，以期对WD患者的临床诊疗有所裨益。

1 WD基因及其发病机制

WD基因（ATP7B基因）位于13q14.3，全长约80 kb，含有21个外显子和20个内含子，其cDNA编码一种由1 465个氨基酸残基组成的P型铜转运ATP酶（ATP7B蛋白）。目前已发现超过500种ATP7B基因的突变类型，多为复合杂合突变，纯合突变少见，不同种族和人群的突变特征存在明显差异［5，7］。

研究表明，WD患者因ATP7B基因突变，位于反面高尔基网状结构（trans Golgi network，TGN）的ATP7B蛋白功能缺陷，不能将肝细胞中的铜离子与铜蓝蛋白前体结合而出现铜蓝蛋白合成障碍，同时位于胆管膜侧的ATP7B蛋白不能将细胞内多余的铜离子随胆汁排出，导致过量的铜在肝脏、大脑和角膜等部位沉积而发病，患者以急慢性肝炎、肝硬化、锥体外系症状及角膜K⁃F环等为主要临床表现，严重者可危及生命［8］。

2 WD的基因诊断

基因诊断可对无临床表型的症状前期WD患者或杂合子作出准确诊断，特别对有家族史的个体或产前的胎儿是否携带WD致病基因具有指导意义。现简要介绍各种先后应用于WD基因诊断的技术方法。

2.1 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）⁃家系连锁分析、单链构象多态性（single strand conformation polymor⁃phism，SSCP）、变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）和实时荧光定量 PCR（quantitative real⁃time PCR，QPCR）分析

自上世纪80年代以来，国内外学者先后探索采用RFLP⁃家系连锁分析、SSCP、DHPLC和QPCR分析等各种用于遗传病基因诊断的技术开展了WD基因诊断的研究，并尝试将其用于WD疑诊患者、无临床症状的WD家系成员及WD杂合子的诊断［9⁃12］。受当时技术条件限制，这些方法均存在明显的缺陷：RFLP⁃家系连锁分析需与同一家系的先证者进行比较，不能对无WD家族史或家系中先证者已死亡的可疑WD患者进行诊断；SSCP、DHPLC和QPCR分析虽然操作简便、灵敏度较高，但均不能明确ATP7B基因突变的部位和性质。随着DNA Sanger测序技术的应用和普及，这些方法已较少用于WD的基因诊断。

2.2 DNA Sanger测序分析

由于能明确ATP7B基因突变的具体部位和性质，采用DNA Sanger测序对WD基因各外显子进行序列分析是最为准确可靠的方法，被公认为WD基因诊断的“金标准”。自Thomas等首先采用该技术检测WD患者基因突变以来，针对不同种族和人群WD患者的研究积累了大量的研究资料并用于 WD 的临床诊断［4⁃5，12］。

笔者等［13］采用Sanger测序对来自我国华中和华东地区的139例非同源家系的WD患者ATP7B基因第13号外显子进行DNA序列检测，结果共检出6种ATP7B基因的突变类型和1种多态，其中p.Gly988Val杂合突变为首次报道，总的检出率为29.49%（41/139），染色体突变频率为16.19%（45/278），证实了第13号外显子是中国人WD基因的突变热区之一。Dong等［14］应用DNA直接测序技术在632例无血缘关系的中国人WD患者中共检出161种ATP7B基因的突变，其中58种为新的发现，总检出率超过90%（569/632），其中有14种突变类型占所有检出突变患者的94%（537/569）。该研究不仅得到较为完整的中国人WD基因突变谱，且进一步证实了WD基因呈少数高频突变类型较为集中而罕见突变类型散在分布的特点。

DNA Sanger测序虽然准确性和可靠性均较高，但对人员、设备要求高，难在一般医院中推广。由于WD基因全长约80 kb，各外显子突变形式多种多样，对所有外显子逐一测序分析花费高、周期长，且不能对其非编码区进行逐一检测，因此，WD的基因诊断亟需各种高通量且费用相对低廉的检测方法。

2.3 DNA微阵列芯片突变分析

DNA微阵列芯片突变分析技术因其固相杂交而具有的并行性和高通量等特点，在生物分子信息获取、基因多态性检测和基因表达谱监测等方面具有明显优势［15］，与WD基因高度遗传异质性的特点相契合，一度被认为是极具潜力的WD基因检测方法。如Gojová等［16］开发了一种可检测87种ATP7B基因突变的DNA微阵列芯片，在97例捷克和斯洛伐克的WD患者中检出43种突变。Mathur等［17］则应用一种可用于检测ATP7B基因突变的低密度DNA微阵列芯片技术，在印度裔WD患者中检出62种突变，其敏感性超过80%。但由于该技术固有的假阳性或假阴性率高等缺陷，目前已被更高通量和准确性且更具性价比的Mas⁃sARRAY和二代测序技术（next⁃generation sequenc⁃ing，NGS）替代。

2.4 MassARRAY突变分析

MassARRAY是将多重PCR技术、质谱技术和芯片技术以及生物信息学方法结合于一体的新一代分子生物学检测平台，具有高通量、高质量、低成本、简单、灵活等优势，目前已广泛用于基因分型、表观遗传学、拷贝数变异、病原体分型和产前诊断等研究［18］。由于WD的基因突变以点突变形式为主，MassARRAY是进行大样本、高通量WD基因突变检测的有力工具。笔者等［19］基于该技术平台筛查了来自800个不同家系的1 222例WD确诊患者的ATP7B基因突变，结果在1 084例患者检出63种已知的突变类型，其中超过80%患者的突变位于第8、13、18、16和12外显子。基因型与临床表现的研究结果发现，检出p.Arg778Leu突变的患者发病年龄更低，且其铜代谢指标（铜蓝蛋白和血清铜）的水平也显著低于未检出该突变的患者；检出p.Arg919Gly突变的多为脑型患者（以神经系统症状起病），而检出p.Thr935Met突变的患者则多为脑⁃内脏型患者（神经系统和肝、肾等脏器均明显受损）。该研究证实了MassARRAY用于检测WD患者基因突变的优势和价值。

2.5 NGS突变分析

NGS作为新兴的高通量测序技术，一次可以对几十万甚至几百万条DNA分子进行序列测定，使得一次性对一种物种的基因组或转录组进行细致全貌分析成为可能，是对传统测序技术的一次革命，被广泛应用于生命科学特别是基因组学研究的方方面面，例如基因组从头测序（de novo）、重测序（re⁃sequencing）、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等［20⁃21］。

由于NGS的高通量检测特性与WD基因的结构复杂性和突变的高度异质性相契合，近年来将其应用于WD基因诊断的研究倍受关注，相关的报道呈增多趋势。如Poon等［22］采用了MiSeq平台的NGS靶向技术检测了12例WD患者ATP7B基因的部分启动子区和全部编码区序列，深度测序（＞100X）结果共检出13种已知突变和一种未曾报道的c.1332delC缺失突变，其结果与Sanger测序的符合率为100%。笔者等［19］在前述研究中则应用NGS检测了在MassARRAY平台未检出ATP7B基因突变的138例WD患者，结果共检出25种突变类型，其中9种为未曾报道的突变类型。在此基础上，笔者等与相关单位合作，采用AmpliSeq方案设计了包含303个扩增子的ATP7B基因全外显子检测Panel，在平均测序深度约1000X的情况下，其编码区的覆盖率约99.5%，利用Ion Torrent高通量NGS平台完成了2 853例WD患者DNA样本的检测，已初步分析检测到435种与WD相关的致病突变或疑似致病突变（未发表）。这些研究结果展示了NGS在WD基因诊断中所具有的广阔应用前景。

3 WD的产前诊断和植入前诊断

产前诊断可以在出生前即可诊断胎儿是否为WD患者，决定是否继续妊娠，从而防止WD患儿的出生，对降低WD的发病率、提高出生人口的素质有决定性意义。

早于WD基因克隆前，Cossu等［23］于1992年即报道采用RFLP⁃家系连锁分析方法对WD家系成员进行产前诊断的研究。在WD基因克隆后，有学者采用直接分析ATP7B基因突变的方法对WD家系成员实施产前诊断。如杜娟等［24］采用DHPLC技术对6个WD家系的父母亲、先证者和胎儿行ATP7B基因突变的筛查，经Sanger测序验证在2个家系中发现存在ATP7B基因突变的异常胎儿，证实了DHPLC在WD突变检测和产前诊断中应用价值。

由于常规的产前诊断方法均需在妊娠过程中从孕妇羊膜腔抽取羊水提取胎儿的基因组DNA，系有创性的侵入性检查，有可能影响孕妇和胎儿的安全，因此有学者探索采用各种无创性检测技术开展WD产前诊断的研究。如Lv等［25］采用外周血单分子扩增和重测序技术（circulating single⁃molecule amplification and resequencing technology，cSMART）这一无创性产前诊断技术对4个WD家系进行了研究。该研究首先采用Sanger测序和全外显子组测序技术检测了WD家系父母亲和先证者ATP7B基因的突变，然后采用cSMART从孕妇外周血分离胎儿基因组并检测是否发生ATP7B基因的突变。经羊膜腔抽取羊水后的产前诊断证实，有1个WD家系的胎儿与先证者基因型相同，为发生WD基因突变的患者，从而验证了无创性产前诊断应用于WD的可行性。

胚胎植入前遗传学诊断（preimplatation genet⁃ic diagnosis，PGD）可利用分子生物学检测技术选择无遗传性疾病的胚胎植入子宫，使有遗传病史的夫妇获得健康的婴儿，避免生出有病的后代以及反复人工流产或者引产导致的身体、精神上的创伤和经济上的损失［26］。虽然到目前为止尚未见WD家系行PGD的报道，但随着单细胞基因组测序［27］以及基于NGS靶向测序技术的不断完善和发展，WD家系行PGD已逐渐成为可能。

4 WD的基因治疗

目前以青霉胺为代表的金属络合剂驱铜治疗和硫酸锌或葡萄糖酸锌等锌剂为主的竞争抑制铜吸收等治疗方法均可在不同程度上纠正WD患者体内铜的“正平衡”而具有改善病情的作用，但这些方法均为对症治疗，且有相当一部分患者不能耐受青霉胺等药物的不良反应，使其治疗范围和效果严重受限。原位肝移植治疗虽能挽救一部分以暴发性肝功能衰竭起病的腹型WD患者的生命，但受器官移植后免疫排斥反应、费用昂贵及肝源获取困难等限制，难以作为常规治疗方法［4，6，28］。作为单基因遗传病，且其致病基因的定位、结构和功能均较为明确，WD最理想的治疗方法当属基因治疗。

基因治疗是指以遗传学原理及基因工程技术为基础，在分子水平进行修补、矫正、替代缺陷基因或调控其表达的治疗方法。由于目前WD的基因治疗均以动物模型为研究对象，选择符合WD遗传背景的动物模型是判定基因治疗能否成功的重要环节。但目前应用于WD基因治疗的LEC大鼠、TX小鼠及atp7b（⁃/⁃）小鼠的表型虽然与WD类似，但其遗传背景、生化特征与WD患者存在较大差异［29］。基于此，Jiang 等［30］应用 CRISPR/Cas9 系统获得了p.Arg778Leu基因型（中国人WD患者的高频突变位点）的ATP7B基因点突变兔子，发现其肝铜含量逐渐增高（最高超过对照组9倍），从而得到了最接近于中国人WD遗传背景的动物模型，为下一步WD基因治疗的研究奠定了良好的基础。

为了解决替代基因的靶向性和载体的安全性等问题，Murillo等［31］以改造的腺相关病毒8（adeno⁃associated vector serotype 8，AAV8）为载体，将人全长ATP7B基因通过静脉注射的方法导入atp7b⁃/⁃小鼠的肝脏，发现其能在肝脏组织中长期表达，并能部分纠正铜代谢的异常。Roybal等［32］则将含有人野生型ATP7BcDNA和肝脏特异性启动子的重组慢病毒（lentivirus）载体采用羊膜腔注射的方法进行atp7b⁃/⁃小鼠基因治疗的研究，结果发现出生后的模型小鼠肝组织出现较长时间的重组人ATP7B蛋白的表达，且铜代谢异常也有明显改善。尽管这些研究尚处于实验室探索阶段，走向临床应用尚有待时日，但这些研究结果显现出基因治疗应用于WD的诱人前景。

5 小结

综上所述，目前各种应用于WD的基因诊断方法中，DNA Sanger测序的重要性不言而喻，NGS靶向测序等高通量测序技术的应用被认为是近年来WD分子诊断领域最重要的进展。而基于WD基因诊断技术之上的产前诊断特别是非侵入性的PGD可使有家族史或存在遗传风险的WD家系成员避免生出有病患儿，在真正意义上阻断WD的发生，对优生优育和提高出生人口的素质有重要意义。但由于产前诊断和PGD涉及生殖医学与遗传学、分子生物学、组织胚胎学等领域，技术门槛高且涉及“胎儿设计”和非医学的性别选择等医学伦理问题，因此，除了在诊断技术上实现高灵敏度和准确度外，严格的准入制度、成熟的技术流程以及医学伦理学的支持是其在临床中规范化推广应用的前提保证。虽然基因治疗作为WD的根治方法尚处于实验室研究阶段，但随着CRISPR/Cas9等新一代基因编辑技术的出现和逐渐成熟，在分子水平精确修正WD的突变基因在不久的将来有可能成为现实。