分子诊断技术在心房颤动临床诊疗中的应用

张维贞 向丽 黄山

心房颤动（atrial fibrillation，AF）简称房颤，是一种临床上最常见的与年龄有关的心律失常，其患病率与年龄的增长呈正相关，60岁以下的人群患病率约为1%，75至84岁人群的患病率增加至12%，而超过80岁的老年人中，大约有1/3都患有AF［1］，AF 在我国的患病率为 0.77%［2］。AF 的发病机制很复杂，其遗传性、临床表现及预后表现出多样性，引起的并发症严重威胁患者生命［3］，给临床诊断和治疗带来一定的难度，因此，分子生物学技术在AF的诊断、治疗中的意义也越来越明显。本文就分子诊断技术在心房颤动中临床应用的研究进展进行简要综述。

1 AF与电重构及结构重构

心房电重构是指快速的心房搏动引起一系列心房肌电生理特性，心房有效不应期缩短和心房肌动作电位时程均显著缩短，在AF的维持和发展中起重要的作用。研究表明，心房肌细胞离子通道的mRNA及蛋白质表达发生改变所致各种跨膜离子流的变化是心房电重构的基础［4］。AF时心房收缩频率增加，反复刺激可导致心房电重构，心房肌细胞钙离子超载，钙通道失活以及离子通道蛋白减少，L型钙通道下调，钙离子内流减少，并上调内向整流钾通道和乙酰胆碱依赖钾通道，超极化增加外向钾电流，导致心房有效不应期缩短，动作电位时程缩短，离散度增加，易于心房快速刺激与折返形成，起到促进房颤的作用。

AF除了会引起心肌电重构外，还可导致患者的心房结构重构。研究者发现，AF患者经治疗后转复为窦性心律，其紊乱的心肌电重构可能会恢复，但心房组织结构却存在持续的变化，进而再次诱导AF，这表明AF诱发的心房结构重构能增加患者心脏对AF的易感性以及持续性［5］。间质纤维化是导致心房结构重构的主要原因，其特点是成纤维细胞增加，心肌细胞外间质胶原过度沉积，心房纤维化会破坏心肌电传导的连续性，引起局部传导障碍，促进折返形成和局部激动的触发，有利于形成更多的多发子波，易于AF的形成和维持。大量实验证实，肾素血管紧张素醛固酮系统（rein angiotensin aldosterone，RAAS）以及转化生长因子 β1（transforming growth factor⁃β1，TGF⁃β1）参与心房的结构重构［6］。血管紧张素Ⅱ（angio⁃tensin II，AngⅡ）是RAAS中主要的活性物质，也是介导心肌纤维化左室重构的重要因素，研究表明，血管紧张素Ⅱ可通过多种途径参与心肌纤维化［7］。此外，还有报道使用RAAS抑制剂在一定程度上可抑制心房肌纤维化，延缓AF的发生［8］，从另一角度表明RAAS对心房纤维化的作用。

TGF⁃β1是由心肌细胞和成纤维细胞分泌的，能促进细胞外基质沉积的重要促纤维化因子［9］。研究者对过度表达TGF⁃β1的山羊模型进行研究，发现与对照组比较，纤维化加重，同时AF的易感性增加，提示TGF⁃β1参与AF心房纤维化的过程［10］。

AF的发病机制复杂。AF的发展是受多种机制协同作用的，心房电重构、结构重构是引起房颤发生和维持的重要原因，今后还需进一步从深层次去研究房颤发生、发展以及维持的关键因素。

2 分子诊断技术在AF诊断中的临床应用

分子诊断技术是以人体生物大分子物质为研究对象，应用相应的分子生物学技术和方法来研究结构或表达上调控的变化，为临床疾病的预测、诊断与治疗提供相应的依据［11］，广泛应用于单基因疾病、多基因疾病、肿瘤及感染性疾病等领域的分子诊断。AF是一种受环境和多种基因共同作用的疾病，限制了疾病基因的研究［12］，很难确定其遗传标记。因此，单核苷酸多态性（single nucleo⁃tide polymorphism，SNP）检测、DNA甲基化检测、miRNA检测及蛋白质组学分析等诊断方法可用于AF相关基因的检测，以及有关复杂疾病机制研究。近年来，随着高通量分子检测技术的不断发展，其在AF的病变基因筛查、诊断中发挥了巨大的作用。

2.1 基因单核苷酸多态性（SNP）检测

单核苷酸多态性是指DNA序列中单个核苷酸发生变异，是人类最常见的遗传变异之一。由于其具有标记数量众多、分布广及遗传稳定性好等特征，因此，比较人群中个体的遗传多样性、分析基因多态性、研究群体中的药物基因组学有重要意义。

肾素是由肾近端球状细胞分泌的蛋白水解酶，当肾血流量减少或血浆Na+含量下降时引起肾素分泌的增加。肾素可将来源于肝脏的血管紧张素原转换为血管紧张素 I（angiotensin I，Ang I），然后血管紧张素转化酶（angiotensin converting en⁃zyme，ACE）催化Ang I使其转化为血管紧张素Ⅱ，刺激肾上腺皮质细胞释放醛固酮，血管紧张素Ⅱ可引起心房传导异质性，缩短心房有效不应期，为AF的发生提供了电生理基础。研究证实，系统和局部RAAS激活导致的心房重构是AF发生和发展的关键［13⁃15］。研究发现，AGT⁃M235T 多态性与AF有关［16］。Hou等［17］以82例 AF患者和82例正常对照组为研究对象，应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（restriction fragment length poly⁃morphic polymerase chain reaction，RFLP⁃PCR）技术进行分析并得出AF与M235T相关的结论，同时发现AGT⁃M235T呈现多态性，AGT⁃M235T基因的T等位基因增加了AF的风险。梁晶等［18］在对中国汉族人群进行基因位点和单倍型分析时，发现AGT基因的rs11568023和rs2478523位点与非家族性AF相关。还可以由NCBI Genbank上获得的AGT、TGF⁃β1等相关基因SNP位点的基因序列，依据基因序列设计特异性上下游引物，PCR扩增产物纯化后经测序检测，将测序结果与NCBI Gen⁃bank中公布的基因SNP位点的标准序列进行序列比对，DNASTAR软件观察测序峰型，得出相应的结论，探讨基因SNP位点与AF的相关性。目前关于SNP位点检测技术包括全基因组关联研究（genome⁃wide association study，GWAS）、TaqMan探针技术、RFLP⁃PCR以及焦磷酸测序等［19］。随着分子诊断技术的不断发展，人们逐渐意识到SNP与AF的易感性有着很大的相关性，这些SNP位点为进一步阐明AF的分子机制提供了更多有价值的线索，为临床发现AF的致病基因和AF的相关诊断提供了新的思路。

2.2 DNA甲基化检测

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的作用下，胞嘧啶⁃磷酸⁃鸟嘌呤二核苷酸（cytosine phosphate⁃guanosine，CpG）中的胞嘧啶与甲基基团共价结合，是最常见的表观遗传学修饰之一。DNA甲基化转录过程中稳定染色质结构，是调节基因表达和下游生物过程的重要表观遗传机制［20］。研究证明，DNA甲基化与房颤的发生有一定的关系［21］。最近的研究检查了一个中等大型社区成人中DNA甲基化与AF的关联，并确定了与AF相关的多个甲基化特征，得出DNA甲基化的变化与 AF 相关的结论［20］。随后 ZHAO 等［22］采用全基因组CpG的高浓度甲基化微阵列技术，比较永久性AF患者左心房与正常窦性心律（sinus rhythm，SR）者组织标本DNA甲基化，综合分析全基因组甲基化和mRNA表达谱。研究中发现AF患者中的420个上调基因和567个下调基因，相对于正常SR患者，12个基因低甲基化，8个基因高甲基化。同时为了确定DNA甲基化对基因表达的影响，运用逆转录定量聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative⁃polymerase chain reaction，RT⁃qPCR）分析了其中1个高甲基化基因homeo⁃box A3和3个低甲基化基因C3orf59、RUNX1和钙调磷酸酶1调节物的表达水平，结果表明DNA甲基化介导的基因表达调节可能在AF发病机制中起重要作用。目前DNA甲基化可通过直接测序法、亚硫酸氢盐处理法、基因芯片技术以及高效液相色谱法等多种方法进行检测。基因表达异常的DNA甲基化参与了机体的炎症反应，钠通道和钾通道离子流的改变，纤维化的激活和脂质代谢的降低，在AF的发生发展中扮演重要的角色，为临床寻找新的治疗方案提供参考意见，以便更好地治疗AF。

2.3 miRNA检测

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类高度保守的小的非编码RNA，参与生理和病理下基因表达的转录后调控。研究表明miRNA是一种潜在的新型生物标志物，是基因表达的有力调节者，它们不仅在心血管系统的生理和正常发育中起着关键作用，而且还可用于心血管疾病的诊断和治疗［23⁃24］。越来越多的研究发现，心脏中存在不同miRNA表达，参与调节AF相关的心房重构机制［25⁃26］，有助于 AF 的发生和维持，基于 miRNA 靶点对AF进行干预，在AF的诊断和治疗中具有一定的指导意义。最近一项关于人类右心房组织和绵羊左心房组织的研究中［27］，miR⁃208b 在慢性心房勯动患者中上调，而 miR⁃1、miR⁃499和 miR⁃133a则下调。MiR⁃208b上调可导致心肌肌球蛋白基因激活和肌浆网Ca2+ATP酶2（SERCA2）下调，表明miR⁃208b参与调节心房肌细胞中的Ca2+稳态和电重构［28］，提示这些miRNA可用于研究AF发生和发展中的调控机制。

研究表明，miRNA是AF电重构和结构重构发生和发展的重要调控分子［29］。心肌电重构是AF发生和维持的电生理学基础，其基本机制是心房肌细胞中的跨膜离子通道发生功能及表达上的变化，动态平衡被破坏。研究者［30］用乳鼠心房肌细胞体外模拟AF模型，采用实时荧光定量PCR（quantitative real⁃time PCR，qPCR）、TaqMan探针法对AF组心房肌细胞相关miRNA的表达进行检测时发现，与对照组进行比较，AF组其电重构机制相关miRNAs存在表达差异，其中miR⁃101a、miR⁃101b、miR⁃26a和miR⁃26b 低表达，而 miR⁃21、miR⁃328、miR⁃499高表达，发现 AF 与 miRNA相关。

心房纤维化是心房结构重构的主要原因，其将导致心房电活动的破坏，形成多子波折返，导致AF的发生。miR⁃21在心脏成纤维细胞中的表达增加，抑制miR⁃21表达时可减轻小鼠心脏纤维化，改善其心脏功能，主要是通过靶向作用于SPRY1（sprouty homologue 1）间接抑制蛋白激酶⁃丝裂原活化蛋白激酶活性。miR⁃21在AF患者左心房中表达上调，导致SPRY1表达降低，结缔组织生长因子表达增加，Rac1⁃GTPase和胶原含量增加［31］。在大鼠的缺血性心力衰竭模型中，左心房直接注射抑制剂抑制miR⁃21导致SPRY1上调，纤维化减轻，同时AF持续时间缩短，表明miR⁃21参与AF的结构重构［32］。另外，Cao 等［33］研究发现 miR⁃21通过CADM1/STAT3途径促进成纤维细胞增殖和心脏纤维化，提示miR⁃21是心脏纤维化重塑和AF的重要信号分子，且miR⁃21、CADM1和STAT3可能成为纤维化的治疗靶点。

miRNAs功能异常与AF发生发展密切相关，通过抑制或过表达miRNAs调控其下游靶点，可改善AF发生时的心房病理性重构，达到治疗效果。另外，血浆中检测miRNA，可作为房颤的临床诊断标志物之一，但目前还处于临床研究阶段。miR⁃NA在AF的诊断和治疗中有着巨大的潜力，所以检测miRNA为AF的发生预测、发展、发现新的药物治疗靶点及评估患者预后情况等方面提供新的研究方向与应用前景。

2.4 蛋白质组学分析

蛋白质组学（proteomics）是后基因组学时代的一门新兴学科，是一种应用多种技术方法，在整体、动态、网络的水平上对细胞内全部蛋白质进行研究，通过生物信息学工具进行分析和处理，研究蛋白质组表达功能的技术方法。蛋白质组学是后基因时代生命科学研究的热点及主要内容，因其具有大规模、高通量、高灵敏度等特点而备受世界各国研究者的关注，逐渐应用于生命科学各个领域和疾病分子机制的研究。

AF的发生和维持是由多种信号通路之间共同作用的。在质谱基础上发展的蛋白质组学已成为广泛应用的分析工具，使得人们更全面更系统地了解关于AF具体的发生机制［34］。目前，对AF的蛋白质组学研究内容包括：①运用双向凝胶电泳技术和生物质谱技术，定量分析凝胶中相应的蛋白质，为分析AF提供有价值的蛋白质指标。LAI等［35］首次采用双向凝胶电泳技术和生物质谱技术，发现猪右心房快速起搏6周后心室肌球蛋白调节轻链⁃2V（myosin light chain⁃2V，MLC⁃2V）表达上调。同样，研究者［36］应用双向凝胶电泳技术和基质辅助激光解吸电离质谱技术（matrix assisted laser desorption ionization⁃mass spectrometry，MAL⁃DI⁃MS）对持续性AF患者的右心耳进行蛋白质组学分析，与窦性心律者相比，结果发现有17种差异表达蛋白，成功鉴定了涉及心房重构过程中的特定蛋白。②运用蛋白质组学芯片寻找新的预测AF风险的生物标志物，探索AF潜在的新的生物标志物。Lind等［37］基于邻近延伸测定（proximity extension assay，PEA）技术开发了一种定制蛋白质组学芯片，该技术能够同时测定92种蛋白质。每种蛋白质通过一对互补的抗体进行评估，在这个过程中部分互补的寡核苷酸被连接在一起。通过2种抗体将靶蛋白与寡核苷酸连接，运用实时定量PCR对这些蛋白质进行定量检测。因此，Lind在2个独立的社区队列中，发现脑自然肽N端前体蛋白（N terminal⁃precursor protein of brain natural pep⁃tide，NT⁃ProBNP）和成纤维细胞生长因子 23（Fi⁃broblast growth factor 23，FGF⁃23）与 AF 强烈相关，并且在随后基于队列研究的荟萃分析中，还发现白细胞介素⁃6（Interleukin⁃6，IL⁃6），脂肪酸结合蛋白 4（fatty acid⁃binding protein 4，FABP4）和生长分化因子 15（Growth differentiation factor⁃15，GDF⁃15）在AF的发生发展中起重要的作用。

采用高通量的蛋白质组学对AF进行研究，有助于从分子水平了解AF病理生理学机制，以开发新的药物，发现更安全、更有效的AF治疗方法，并筛选出与房颤诊断、治疗及评估预后相关的生物标志物。当前对于AF的蛋白质组学研究工作还处于初级阶段，发展还未成熟，仍有许多待解决的问题，如缺乏大规模的前瞻性队列研究等。

3 分子技术在AF治疗中的临床应用

目前临床上AF的治疗方法主要是用抗心律失常药物或射频消融术来恢复窦性心律和控制心室率，但效果并不是很理想，副作用大且容易复发，为了提高生活质量，减少AF相关症状，需要研究发现更为行之有效的方法来治疗AF。基因治疗是使用核酸序列来操纵靶细胞或组织中的基因表达，达到特定治疗效果。因此，从基因水平上阻断AF发生与维持的机制，达到根治及预防AF的目的，是临床上非常重视的问题。

近年来，心房颤动的基因学研究已证实了基因在房颤发病、心房重构及房颤维持中的重要作用。目前AF治疗所涉及的基因包括Caspase 3基因、缝隙连接蛋白基因（Cx40、Cx43）、SERCA2a基因等。心房注射、电穿孔方法和心房涂敷技术应用的研究证实，在动物体内加入Cx40和Cx43可有效地改善AF的发生，表明基因治疗AF的可行性［38⁃39］。现在基因治疗中应用最广泛的基因载体是腺病毒载体［40］，研究表明，注射和心房肌电穿孔传递腺病毒载体Ad⁃siRNA⁃Cas3，其编码caspase 3基因敲除的siRNA，减少细胞凋亡，抑制或延迟持续性 AF 的发生［41］。此外，Kuken 等［42］的研究发现，SERCA2a转基因治疗使SERCA2a蛋白的表达上调，心肌细胞肌浆网摄取钙离子进一步增加，从而提高心肌收缩力。由于基因治疗载体可诱导强烈的炎症反应，且目前只研究于动物体内，因此现阶段大多数基因治疗仍处于发展过程的早期阶段，有待进一步的探索研究。

4 展望

AF是一种多基因调控的疾病，由于受环境、基因等因素共同影响，使得其具体的发生发展机制至今仍未明确，临床上AF治疗后容易复发，同样也给临床治疗带来一定的难度。近年来，随着越来越多的遗传因子被发现与AF的发生发展相关联，分子生物学技术也逐渐在AF的诊疗中发挥着作用。国内有关AF相关联基因的研究尚处于起步阶段，AF的临床检测主要还是以心电图或其他影像学方法检测为主，基本上未涉及分子生物学技术，这使AF在个性化诊断和个体化治疗方面都受到了极大的限制。因此，在今后的基础及临床研究中，将分子诊断技术应用于AF的诊断和治疗，加快推广分子技术在房颤诊疗中的临床应用，将对我国AF的诊断、治疗、预后甚至预测方面都有着非常重要的意义。