冠状动脉痉挛发病机制的研究进展及法医学应用

阙春杏 ，虞逸静 ，陈 晗 ，史 程 ，薛爱民 ，3

（1.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032；2.上海市公安局虹口分局刑事科学技术研究所，上海200434；3.上海市现场物证重点实验室，上海 200083）

冠状动脉痉挛是指局部冠状动脉对各类刺激的过收缩反应，其直接结果是冠状动脉部分或完全闭塞，在变异型心绞痛及其他类型的心绞痛甚至心肌梗死、猝死的发病机制中发挥重要作用。1845年，Latham就提出了冠状动脉痉挛可导致心绞痛，直到1959年，PRINZMETAL等[1]学者首次报道了变异型心绞痛，此类型心绞痛与劳力性心绞痛不同，常于静息状态下发作，伴有ST段抬高，同时提出冠状动脉痉挛与其相关。直到1973年，OLIVA等[2]通过冠状动脉造影最终证实此假说成立。此后，冠状动脉痉挛在冠状动脉粥样硬化性心脏病尤其是急性冠脉综合征发病机制中的地位受到越来越广泛的关注和认同。临床上，冠状动脉痉挛好发于青年女性，发作时间多为凌晨，ST段抬高、冠状动脉无病变，但具有典型临床特征的胸痛患者常常被认为受到冠状动脉痉挛的影响[3]。发生痉挛的冠状动脉造成所在供血区域突发缺血，极易造成心肌梗死发生，若梗死范围较大或发生在其他重要部位，则有导致猝死的风险。2000年，一项日本多中心研究[4]表明，日本人群存在冠状动脉痉挛者高达40.9%。2008年，ONG等[5]也表明约50%的急性冠脉综合征患者可被乙酰胆碱诱发冠状动脉痉挛。冠状动脉痉挛的发病率也存在种族差异。有学者[6]认为，西方人的发病率相对较低，而日本人及韩国人的发病率相对较高，并且日本人中弥漫性冠状动脉痉挛（多支冠状动脉发生冠状动脉痉挛）更为常见。由于受各方面条件限制，我国在此方面的研究较少，本文综合国内外冠状动脉痉挛的研究，就其发病机制和法医学应用进行综述。

1 冠状动脉痉挛的诱因

冠状动脉痉挛的诱因主要分为生理因素与药理因素两大类[7]。生理因素包括劳累、精神应激、寒冷刺激、瓦尔萨尔瓦动作、过度通气、镁缺乏等，另外冠状动脉痉挛本身也可参与而构成恶性循环。药理因素包括烟、酒、儿茶酚胺、组胺、拟副交感神经药、抗胆碱酯酶药、麦角新碱、β受体阻滞剂、可卡因、长期应用硝酸甘油者突然撤药等。此两大类因素可分别单独诱发冠状动脉痉挛，若两者并存时，则发病率更高。

2 冠状动脉痉挛的分子机制

虽然氧化应激引起的血管收缩、慢性炎症造成的血浆C反应蛋白升高、自主神经兴奋性增高及遗传因素等是冠状动脉痉挛的常见机制[8]，但这些因素主要造成血管内皮功能障碍或血管平滑肌兴奋性增高等[8]。因此，本文将重点讨论血管内皮功能障碍和平滑肌兴奋性增高在冠状动脉痉挛中的作用，并选取主要的分子标志物，介绍其在介导冠状动脉痉挛中的作用。

2.1 血管内皮功能障碍

血管内皮细胞作为全身血管内和血管外成分的重要屏障之一，在血管内环境稳态的维系方面发挥着举足轻重的作用[9]。同时，血管张力的维持和调节有赖于内皮细胞产生和释放的血管活性因子，其中主要的血管舒张因子有一氧化氮、前列环素，主要的血管收缩因子有内皮素（endothelin，ET）-1。在生理情况下，血管舒张因子和血管收缩因子处于动态平衡之中。血管舒张剂如乙酰胆碱，通过诱导内皮细胞释放一氧化氮而实现其扩血管作用[10]。然而，具有冠状动脉痉挛病变的患者，可被醋甲胆碱或乙酰胆碱诱发冠状动脉痉挛[11-12]。有研究[10，13-15]发现：乙酰胆碱、5-羟色胺和组胺等，在健康人身上通过促进内皮源性一氧化氮的释放，进而发挥扩张冠状动脉的作用；而在存在动脉粥样硬化病变的患者身上，则诱发冠状动脉痉挛。由此可见，冠状动脉痉挛的患者，存在冠状动脉内皮功能障碍。

2.1.1 内皮源性一氧化氮在冠状动脉痉挛中的作用

1980年，FURCHGOTT等[16]发现，内皮细胞能分泌一种内皮源性舒张因子，并确认其为一氧化氮，自此之后，内皮细胞在调节局部血管张力中的作用逐渐被揭示。内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸的反应中产生一氧化氮。硝酸甘油在人体内被分解，释放出一氧化氮，后者激活邻近的平滑肌细胞内的可溶性鸟苷酸环化酶，间接促进环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）的大量产生[10]，从而导致平滑肌舒张，冠状动脉痉挛缓解。当内皮细胞存在eNOS缺陷时，痉挛的冠状动脉对硝酸甘油处于高反应状态[17]，硝酸甘油的生理效应更为显著。进一步研究揭示，eNOS抑制剂单甲基-L-精氨酸能导致健康人的冠状动脉显著收缩，却对冠状动脉痉挛患者的冠状动脉无此效应[18]。由此可知，一氧化氮的舒张血管作用极有可能仅用于维持血管的基础张力水平，而在痉挛的冠状动脉中无此作用。

现有研究[19]发现，eNOS的基因突变可能通过改变一氧化氮的释放量从而参与调节冠状动脉痉挛的发生，不排除其机制与内皮细胞功能障碍相关的可能性。1997年，YOSHIMURA等[20]首先在日本人中发现Glu298Asp多态性和冠状动脉痉挛的关系。CHANG等[21]在韩国选取102名变异型心绞痛患者进行研究，发现：其中21.5%的人存在eNOS基因的Glu298Asp突变；eNOS基因的Glu298Asp突变可较好地预测冠状动脉痉挛风险（OR=2.83）。尽管Glu298Asp突变与冠状动脉痉挛密切相关，然而，该突变的效应是否通过影响一氧化氮的释放起作用存在争议。SOFOWORA等[22]报道了健康人中Glu298Asp突变型较野生型释放更少的一氧化氮。TESAURO等[23]和FAIRCHILD等[24]则认为Glu298Asp突变与否对一氧化氮的释放无明显影响。此外，在eNOS基因的5′侧翼区的T-786C多态性也被证实与冠状动脉痉挛存在密切关系。研究[7，25-29]发现，在日本人、巴西白人和非裔巴西人中，T-786C突变后可通过减少一氧化氮的产生而在一定程度上促进冠状动脉痉挛的发生。GLUECK等[30]深入研究发现，美国白人中变异型心绞痛患者的T-786C位点的突变率远高于健康人。

2.1.2 ET-1在冠状动脉痉挛中的作用

ET-1主要由血管内皮细胞合成和分泌，是强烈的内源性缩血管物质。LEE等[31]曾报道韩国冠状动脉痉挛人群中，血浆ET-1存在基因多态性，并提示血浆ET-1的变化可能由其基因多态性所致。张金霞等[32-34]在中国人群中发现，冠状动脉痉挛患者的血浆ET-1水平显著高于健康人群和冠状动脉狭窄的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者。LEE等[31]也发现韩国冠状动脉痉挛人群的血浆ET-1基因的突变主要在外显子-5第5665位点、外显子-1+138位点和内含子-4第8002三个位点这三个位点，并且ET-1的水平与此三个突变密切相关。曾菁等[35]在中国人群中展开研究：一方面发现在上述三个位点的突变与血浆ET-1水平关系密切；另一方面，通过对基因组的分析，发现等位基因4A（在第8002位点为A，在第5665位点为T的突变）与冠状动脉痉挛的发生具有明显的联系，而等位基因3A（在第8002位点为G，在第5665位点为G的突变）则对冠状动脉痉挛的发生起保护作用。目前研究[36]提示，血浆ET-1水平和冠状动脉痉挛的发生关系密切，而前者与其基因多态性的相关性则有待深入探究。

此外，低密度脂蛋白[37]和吸烟[38]可以诱导动脉血管平滑肌细胞ET A型（ETA）受体或ET B2型（ETB2）受体的表达，使血管敏感性增加，表现为平滑肌高反应性和ET-1收缩效应的显著增强，增加冠状动脉痉挛的发生风险。

2.2 血管平滑肌兴奋性增高

血管收缩依赖于细胞内Ca2+浓度和平滑肌对Ca2+的敏感程度两个关键因素。当平滑肌细胞受到刺激，细胞内外钙通道打开，胞质内Ca2+浓度升高至激活浓度时，Ca2+便与钙调蛋白结合，进而通过一系列反应激活肌球蛋白，并激活其上的ATP酶使之分解ATP产生能量令横桥扭动，平滑肌收缩。在激活肌球蛋白的过程中，肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）磷酸化和Rho激酶共同参与平滑肌细胞对Ca2+增敏的调节。在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应以及钙离子稳态失衡等情况下，血管平滑肌细胞将启动内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），后者与 MLC的磷酸化相互影响，介导血管的过度收缩和痉挛，ERS或为冠状动脉痉挛的重要始动因素。因此，血管平滑肌兴奋性增高可能是冠状动脉痉挛的重要病理生理机制之一。

2.2.1 MLC磷酸化在冠状动脉痉挛中的作用

肌球蛋白为包括2个肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）和 2 对轻链（MLC1 和 MLC2）的六聚体。其中以MLC2为功能代表的肌球蛋白在Ser19和Thr18位点可被磷酸化[39-40]。冠状动脉痉挛与MLC磷酸化的增强密切相关[41]。Ca2+-钙调蛋白活化的MLC激酶（myosin light chain kinase，MLCK）及随后发生的MLC调节亚基的磷酸化共同启动血管平滑肌的收缩[42]。磷酸化的MLC进而活化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶，从而允许横桥循环的发生，最终导致平滑肌收缩力的产生以及血管收缩[42]。在白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）β诱导的猪冠状动脉痉挛模型中，冠状动脉痉挛段的MLC单磷酸化水平和双磷酸化水平均升高，而正常冠状动脉并未发现MLC双磷酸化水平的升高[43]。在培养的平滑肌细胞中，MLC的双磷酸化在活跃生长的平滑肌细胞中具更高水平[44]。这些结果提示了MLC双磷酸化仅在冠状动脉痉挛区的平滑肌细胞内发生。

2.2.2 Rho激酶在冠状动脉痉挛中的作用

体外实验[45]表明，鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）结合蛋白可以调节受体介导的MLC磷酸酶的敏感性。Rho GTP酶参与调节平滑肌对Ca2+的敏感性[46-48]。Rho通过调节其靶酶Rho激酶以及肌球蛋白激酶的肌球蛋白结合亚基（myosin-binding subunit，MBS）来调节MLC的磷酸化[49-50]。活化的Rho可以和Rho激酶、MBS相互作用，从而活化Rho激酶并使MBS转位。活化的Rho激酶随后使MBS磷酸化，由此使肌球蛋白磷酸酶失活[50]。Rho激酶本身也可以在MLCK磷酸化MLC的同一位点将MLC磷酸化，从而在体外环境激活肌球蛋白的ATP酶[49]。活化的Rho激酶增强了MLC的磷酸化从而诱导平滑肌收缩[51]。目前研究[46]认为，Rho激酶通过调节平滑肌对Ca2+的敏感性而诱导平滑肌收缩。小型猪冠状动脉痉挛处的Rho/Rho激酶在mRNA、蛋白质和分子活性水平均显著上调[52]，然而采用特异性抑制剂抑制Rho激酶活性后，冠状动脉痉挛可显著减少[53]。

2.2.3 ERS对冠状动脉痉挛的作用

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌的重要细胞器。ERS是指在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应以及钙离子稳态等失衡情况下，内质网未折叠或错误折叠的蛋白质明显增多，当超出内质网处理能力时，将激活转录活化因子 6（transcription factor 6，ATF6）通路、肌醇依赖酶 1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）通路和蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）通路[54]，通过一系列相关信号级联反应，来帮助细胞应对条件的变化和维持自身稳态。ERS直接影响应激细胞的转归，如适应、损伤或凋亡[55]。

研究[56]发现，ERS抑制剂牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）作用于自发性高血压性大鼠后，冠状动脉的肌张力恢复正常。采用另一种ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）连续腹腔注射1周后，发现小鼠右心室收缩压下降30%，右心室肥厚和肺动脉肌化得到显著改善[57]。进一步研究[58]揭示，血管平滑肌细胞内异常的ERS导致了主动脉血管收缩反应性增高，引起血压升高。ERS被干扰后，血管平滑肌细胞收缩性显著下降。同时ERS对主动脉收缩反应的调节作用不依赖于内皮细胞[58]。此外，ERS的IRE1通路与肌球蛋白ⅡB有关。肌球蛋白ⅡB通过促进MLC2磷酸化，介导了IRE1α的聚集[59]。ERS激活后，伴随MLC的磷酸化增多[58]。可见，ERS是血管收缩的重要因素。

3 展 望

表1 各种分子对冠状动脉痉挛的影响

冠状动脉痉挛目前被认为是一种由多分子通路介导的急性冠状动脉综合征（表1）。一方面，血管内皮细胞所释放的血管收缩因子和血管舒张因子的动态平衡，是调控血管张力的重要机制，一旦平衡被打破，如一氧化氮释放减少或ET-1释放增加，将导致血管内皮功能障碍，增加冠状动脉痉挛的发生风险。另一方面，血管平滑肌细胞是血管收缩的直接执行者，其对血管张力的调控至关重要。当血管平滑肌细胞发生MLC磷酸化、Rho激酶功能异常以及ERS时，血管平滑肌细胞对钙离子处于高度敏感状态，冠状动脉痉挛的发生率大为增高。

在法医病理学鉴定实践中，部分心脏性猝死的案例尸体检验时无明显的形态学改变或病变较轻（如冠状动脉粥样硬化，管腔狭窄Ⅰ～Ⅱ级），同时还存在部分青壮年猝死综合征的案例，其死因也高度怀疑为心源性疾病，是法医学鉴定中的难点。在猝死疾病中，若冠状动脉粥样硬化伴随管腔狭窄Ⅲ级或以上，在排除其他死亡原因后，可作出冠状动脉粥样硬化性心脏病死亡的病理诊断。然而，很多猝死的案例在系统解剖后仅可见冠状动脉轻微病变，管腔狭窄程度低于Ⅱ级。针对这部分案例，有学者[65]建议，如果死者生前存在明显诱因（如与人争执、寒冷刺激等），则高度怀疑为生前冠状动脉痉挛导致死亡，但法医病理学鉴定中缺乏有效检测手段。FACTOR等[66]最先发现在63例无明显阳性改变的心脏中，47例（74.6%）案例的冠状动脉中膜层出现明显的血管平滑肌收缩带，并且在这47例心脏中，78.7%高度怀疑为冠状动脉痉挛致死。鉴于血管平滑肌收缩带与冠状动脉痉挛的高度相关性，FACTOR等[66]提出平滑肌收缩带可作为诊断生前冠状动脉痉挛的重要指标。与非冠状动脉疾病相比，内弹力膜和内膜折叠度也被发现在冠状动脉痉挛后显著改变[67]。此外，LIN等[68]发现血管平滑肌强直痉挛可伴随其他形态学改变，包括细胞纵向短缩，胞核缩窄、重叠等，并提出这些形态学改变可用于诊断冠状动脉痉挛。这些重要的形态学发现推动了冠状动脉痉挛研究的进展，然而基于形态学的观察存在主观性和观察者的判断差异性。实际检案中，某些案例依旧只能依靠推测，判断冠状动脉痉挛导致心脏性猝死，结论往往容易引起争议[69]。研究[10，32，60-62]发现，一氧化氮、ET-1、磷酸化的MLC、Rho激酶和ERS等与冠状动脉痉挛存在密切关系（表1）。其中，磷酸化的MLC和Rho激酶在冠状动脉平滑肌细胞中的表达水平升高，可用于预测急性心肌梗死等疾病。此外，在血液中筛选和鉴定一氧化氮和ET-1理论上是可行的，并且有研究[32，60-62]证实二者在血液中的水平对部分心血管疾病有预测意义。考虑到司法实践中组织样本不易保存和携带，易受腐败影响，而血液方便存取，在濒死期由医疗机构或死亡早期由司法鉴定人员抽取、保存更为容易，因此一氧化氮和ET-1有望成为潜在的冠状动脉痉挛诊断指标。对于上述分子与冠状动脉痉挛的关系的探讨，需要更多的科学研究加以佐证，届时将其应用于高度怀疑冠状动脉痉挛致死的案件中，为法医工作者诊断冠状动脉痉挛提供辅助依据。

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