骨肉瘤治疗相关纳米粒子的研究进展

王艳华，覃娜，鲁仕琦

三峡大学医学院 病理学系，湖北 宜昌 443002

骨肉瘤是20岁以下青少年最常见的恶性实体肿瘤，起源于骨间质组织，具有高度恶性、强力侵犯和早期肺转移的特点[1-2]。骨肉瘤的临床治疗远不理想，虽然随着三联抗癌治疗策略的快速发展，患者的总生存率提高了20% ～30% ，但截肢术后5年存活率仅5% ～15%(3)。因此，寻找更有效的治疗策略是当前骨肉瘤防治研究的重点。纳米粒子是指有一维尺寸处于1～100 nm量级的小粒子，借助其纳米尺寸效应，它们可通过高通透性的肿瘤血管，富集于肿瘤内，即具有高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR效应），抑制其生长和发展[4-5]。除了自身具有抗肿瘤作用外，一些纳米粒子还可作为抗肿瘤药物载体，加载多种抗肿瘤药物，靶向投递于肿瘤组织内，协同增强抗肿瘤效应[6-10]。本文综述近年来与骨肉瘤治疗密切相关的纳米粒子的研究进展，以期为骨肉瘤的临床治疗提供参考。

1 无机纳米粒子

1.1 羟基磷灰石基纳米粒子

羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA），是人体骨和牙最主要的无机晶体[11]。纳米羟基磷灰石不仅具有良好的骨诱导性能，还具有强的抗肿瘤特性。当前围绕HA纳米粒子的研究也取得了一些进展，尤其是作为纳米药物载体应用于骨肉瘤的治疗研究之中。Wu等制备了载2种药物（二磷酸盐和溴结构域蛋白抑制剂）的HA纳米粒子，利用K7M2骨肉瘤细胞模型评估了它们的抗癌性能，发现2种抗癌药物均使HA结晶性能降低，尤其是具有高亲和性的二磷酸盐；载溴结构域蛋白抑制剂的HA纳米粒子不仅能在骨肉瘤细胞内缓慢释放药物，还能抑制骨肉瘤细胞向成骨细胞分化，下调Ezrin的表达，上调RUNX2的表达[12]。Dhar⁃man等采用超声波辐射的方法制备了不同浓度的铋（Bi）和矿物（M）取代的HA纳米粒子Bi-MHAP，观察了它们对骨肉瘤细胞集落形成及体内肿瘤生长的影响。结果发现，该纳米粒子不仅能促进成骨增殖、增强机械强度，还能抑制肿瘤细胞集落形成和肿瘤组织的生长[13]。Lin等利用简便的共沉淀法制备了SF/n-HA复合材料，并将其沉积于钛合金基片表面，定量分析了SF/n-HA纳米复合材料对骨肉瘤MG63细胞成骨分化的影响。经扫描电子显微镜（SEM）和MTT测试发现，该纳米复合物具有较好的生物活性，成骨细胞易于黏附生长。Western印迹表明该纳米材料作用后的骨肉瘤细胞碱性磷酸酶（ALP）活力下降，骨钙素（BGP）和Ⅰ型胶原（ColⅠ）表达量增高，说明SF/n-HA复合材料具有较好的细胞黏附和成骨分化潜能[14]。以上研究表明，以无机HA为基础的纳米药物载体，可通过多种方式抑制骨肉瘤生长，有望应用于骨肉瘤的治疗中。

1.2 金属基纳米粒子

近年来，金属基纳米粒子备受学者们青睐。如Ag、Ti、Zn、Ce、Au等金属，由于各自独特的本征特性，可通过多种方式制备成纳米颗粒，用于骨肉瘤的治疗。Nayak等介绍了一种利用树皮（来自孟加拉榕和印度苦楝树树种）提取物制备银纳米粒子的绿色合成方法，并评估了它们的抗微生物活性和对抗骨肉瘤增殖效应。动态光散射（DLS）表征分析显示，由孟加拉榕树皮合成的纳米粒子尺寸约85.95 nm，而由印度苦楝树树皮合成的纳米粒子尺寸为90.13 nm。UV-Vis测试发现，2种树皮提取物合成的纳米粒子在426和420 nm波长处均具有吸收峰。经场发射扫描电镜（FSEM）、X线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、原子力显微镜（AFM）表征发现，所合成的纳米粒子为60 nm的球形粒子，具有银离子特有的衍射峰和功能基团。这些纳米粒子能对抗革兰阴性菌（如大肠杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌）和阳性菌（如枯草芽孢杆菌）的生长，它们的最小抑菌浓度（MIC）分别为 12.5和 25 μg/mL。所合成的纳米银对骨肉瘤MG63细胞也显示了剂量依赖式的抗增殖作用，其半数抑制量（IC50）分别为81.8±2.6（由印度苦楝树树皮制备）和75.5±2.4 μg/mL（由孟加拉榕树树皮制备）。以上结果提示，所合成的纳米银粒子可作为广谱抗肿瘤和抗微生物治疗剂使用[15]。Kovacs等利用P53基因在多种肿瘤中功能缺失这一特性，提出了基于激发P53功能的治疗策略的巧妙思路，制备了银纳米粒子，检测了它们对P53抑癌基因功能缺失的骨肉瘤细胞（U2OS、Saos-2）的胞毒效应。结果发现，用5和35 nm尺寸的柠檬酸包被的银纳米粒子处理后的骨肉瘤细胞线粒体结构和功能紊乱，细胞凋亡率增高，说明该纳米粒子杀灭骨肉瘤细胞不依赖P53功能状态，这一特征使得银纳米粒子成为化疗策略极具魅力的候选[16]。Iram等报道了一种利用真菌（尖孢镰刀菌）内部转化合成氧化铽（Tb2O3）纳米粒子的绿色制备途径。把Tb2O3纳米粒子与骨肉瘤MG-63和Saos-2细胞共培养，其 IC50为 0.102 μg/mL，而当浓度范围为 0.023～0.373 μg/mL时，骨肉瘤细胞活力呈浓度依赖式降低。形态学研究发现，纳米粒子作用后的骨肉瘤细胞缩小、核固缩、凋亡小体形成。流式细胞术（FCM）测试和DAPI染色证实，肿瘤细胞呈剂量依赖式的凋亡[17]。Ai等报道了一种具有增强抗骨肉瘤效应的叶酸标记TiO2纳米粒子，其尺寸随聚合物的加入而增大，叶酸修饰能提高TiO2的抗骨肉瘤效应，源于叶酸能与肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体特异性结合。尤其是FA-TiO2纳米粒子能导致骨肉瘤细胞染色质浓缩、核固缩和质膜出泡，呈现近38% 的凋亡率，进一步检测发现细胞周期停滞于G0期（G0细胞比例高达25% ），细胞凋亡相关蛋白如细胞色素C、caspase-3、聚ADP核糖聚合酶（PARP）的表达明显增高[18]。Kang等构建了基于Au-Ag纳米棒的近红外光响应性的药物载体系统，包被有DNA交联的聚合物外壳，利用DNA的互补性原则可发展聚丙烯酰胺基溶胶凝胶转化体系，以用于包裹抗癌药物。这种Au-Ag近红外基纳米凝胶也能与它的靶向基团结合从而功能化，比如核酸适配体特异靶向对肿瘤细胞的识别。当暴露于近红外光时，该纳米棒的光热效应十分明显，从而可控释放内部药物。体外研究也显示，核酸适配体功能化的纳米凝胶可作为药物载体，通过近红外光的高空间和温度分辨率效应，实现靶向药物递送的远程可控性[19]。Sisub⁃alan等通过生物学路径合成了ZnO和CeO2纳米粒子，探索了其在生物医学和药学中的利用价值。研究发现，ZnO和CeO2纳米粒子造成骨肉瘤细胞膜损伤，胞内出现氧化应激，使活性氧簇（ROS）升高，进而细胞凋亡[20]。以上研究说明，金属基纳米粒子可通过多种途径合成，并经不同的作用方式抑制肿瘤细胞的生长。

2 有机纳米粒子

2.1 PLGA或PEG高分子有机纳米粒子

聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactic-co-gly⁃colic acid），PLGA］和聚乙二醇（polyethylene gly⁃col，PEG）均是可生物降解的有机高分子[21-22]。利用PLGA或PEG可制备出多种形貌尺寸的微纳米粒子，广泛应用于生物医学领域。Altindal等通过乳剂-扩散-蒸发法制备了褪黑素加载的PLGA纳米粒子和微米粒子，粒径分别约为200和3.5 nm。研究发现，褪黑素加载的纳米粒子包封率为14% ，在生理缓冲液中缓慢释放褪黑素，到40 d结束时其释放量近70% 。骨肉瘤MG63细胞实验表明，当与载有1.7 μg褪黑素的0.05 mg纳米粒子共培养时，细胞生长被抑制，说明褪黑素加载的PLGA纳米粒子具有胞毒作用，可用于骨肉瘤的化疗[23]。Ray等制备了甲氨蝶呤（MTX）加载的PLGA纳米粒子（MTX-PLGA），评价了该纳米粒子的药物代谢动力学、组织分布、动物存活率及抗癌效应。结果表明，该纳米粒子对BALB/c裸鼠的半数致死量（LD50）和抗癌功效均高于纯的MTX化疗，提示该纳米粒子的生物安全性好、抗骨肉瘤性能强[24]。Guan等通过离子交联方式制备了100 nm的mPEG-CS纳米粒子，并以1∶3的比例将该纳米粒子悬液与短发夹RNA（shRNA）溶液混合，转染骨肉瘤MG63细胞，MTT、RT-PCR和Western印迹检测，发现mPEG-CS纳米粒子能下调凋亡抑制蛋白livin和survivin的表达，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[25]。以上研究说明，基于PLGA或PEG的高分子有机纳米粒子也可用于骨肉瘤的治疗。

2.2 脂质基纳米粒子

脂质基纳米粒子在骨肉瘤治疗中的研究较多。Yolanda等通过热乳剂技术将阿霉素（doxoru⁃bicin，DOX）和依地福新（edelfosine）包被于脂质纳米粒子中，观察了它们对耐药骨肉瘤细胞生长的协同抵抗作用，发现它们能逆转由P-糖蛋白（P-gp）表达上调所致的骨肉瘤细胞耐药，且两药具有协同效应[26]。Duan等制备了球形的聚合物脂质杂化纳米粒子（PE-LPN），能加载化疗药物紫杉醇（PTX）和依托泊苷（ETP），可被肿瘤细胞内吞，且两药联合的胞毒作用比单药更强，骨肉瘤细胞Ki-67阳性表达率降低（＜25% ）[27]。Yu等发展了表皮生长因子受体（EGFR）交联的盐霉素（salinomycin）加载的聚合物脂质杂化纳米粒子（EGFR-SNPs），研究了它们靶向肿瘤干细胞（CSCs）和肿瘤细胞的潜能。该纳米粒子尺寸约95 nm，对盐霉素的药物包封率为63% ，并可持续缓释120 h；该纳米粒子还能靶向2种肿瘤细胞，产生胞毒作用，减少CD34+CSCs的比例，抑制癌巢形成[28]。Fateme等制备了脂质化阿霉素（LDOX），通过分析骨肉瘤细胞摄取和细胞活力变化来优化DOX的用药剂量。结果发现，直径为96 nm的L-DOX呈圆球形，对DOX的包封率高达84% ，并能稳定释放14 d，与细胞共培养时能提高细胞通透性，促进细胞死亡[29]。因此，脂质基纳米粒子也具有较好的抗骨肉瘤效应。

2.3 壳聚糖基纳米粒子

壳聚糖又名甲壳素，具有抗菌抗癌等多种生物效应[30-32]。围绕壳聚糖纳米粒子的研究也取得了一定的进展。Tian等利用两亲性嵌段共聚物作为药物载体，制备了粉防己碱加载的CS-PAA纳米粒子。该纳米粒子呈球形，表面带正电荷，能抑制骨肉瘤MG63细胞增殖，促进细胞凋亡。Western印迹证实，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达下调，而促凋亡蛋白Bax表达上调[33]。Li等探索了泊洛沙姆（poloxamer）修饰的三甲基壳聚糖（TMC）包被甲氨蝶呤用于治疗骨肉瘤的可能性。结果发现，甲氨蝶呤加载的聚醚壳聚糖纳米粒子（MTCN）能作为纳米载体，控制药物释放。该纳米粒子可被骨肉瘤MG63摄取，在胞浆内富集产生胞毒作用，促进细胞凋亡（凋亡率高达48% ）。该研究提示，TMC可作为纳米药物载体用于骨肉瘤的化疗[34]。

2.4 肽基纳米粒子和纳米凝胶

肽基纳米粒子和纳米凝胶是近年发展起来的纳米材料，对骨肉瘤具有高度选择性，而对正常细胞低毒。Chang等以两亲性肽C18GR7RGDS作为姜黄素的载体，制备了肽-姜黄素纳米粒子，该纳米粒子可包封姜黄素于它的疏水核心，提高姜黄素的水溶性，细胞实验表明该纳米粒子可选择性抑制骨肉瘤MG-63细胞的生长[35]。Li等制备了肽修饰的聚合纳米凝胶，用以加载紫草素（shi⁃konin），实现靶向骨肉瘤细胞的跨膜投递，细胞和动物实验表明它能促进骨肉瘤细胞凋亡，并遏制骨肉瘤肺转移[36]。以上研究说明，肽基纳米粒子和纳米凝胶均是较好的药物载体，可实现抗骨肉瘤药物的靶向投递。

3 基于纳米脉冲刺激的治疗策略

纳秒脉冲电场（nanosecond pulsed electric field，nsPEF）即纳米脉冲刺激（nano-pulse stimula⁃tion，NPS），具有刺激针对肿瘤细胞的免疫反应的潜能。Chen等研究了NPS对晚期肺转移肿瘤模型动物的局部和全身反应。他们选择了12只自发骨肉瘤的犬和12只荷肝癌的裸鼠，用40 kv/cm强度、1 Hz 500脉冲的电极刺激动物肿瘤组织，观察动物的生存时间、肿瘤尺寸、血清ALP水平、关节囊损伤和肺转移情况。结果表明，NPS无热损伤和关节畸变效应，能遏制肿瘤生长和转移，延长动物生存时间[37]。因此，局部应用NPS是一种无热治疗策略，能减缓骨肉瘤原发病灶的生长，延长生存期。

4 结语

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤，高发于四肢长骨干骺端，临床上易早期复发、血行肺转移。其治疗一般采用大剂量化疗和手术的综合治疗策略，由于诊断技术或手术后预防措施不完善，最终导致治疗不彻底或肿瘤复发。纳米粒子鉴于其自身结构和功能的特殊性，可作为纳米药物载体，推动骨肉瘤治疗研究的进步。基于纳米粒子的骨肉瘤临床治疗前景可望，尤其是作为抗骨肉瘤纳米药物载体的应用。然而当前人们对上述纳米粒子与骨肉瘤相互作用的理论认知和实践应用还存在诸多困难，使其临床应用受到了极大限制，如不同形貌、尺寸的纳米粒子对骨肉瘤的生长是否存在形貌、尺寸依赖的抗癌效应？不同基质纳米粒子抵抗骨肉瘤生长的分子机制是否相同？不同种系骨肉瘤细胞对同一纳米粒子的刺激反应是否存在差异？相信随着对纳米粒子结构-性能关系规律研究的深入，以及它们抗骨肉瘤作用分子机理的阐释，将为纳米粒子应用于骨肉瘤的精准治疗带来一线希望。