重组伪狂犬病毒疫苗研制现状

李文桂,陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）可感染猪、牛、羊、狗、猫、啮齿动物和禽类等，引起伪狂犬病，常伴发神经系统症状、生殖障碍和呼吸道症状等。PRV基因组大小约为150 kb，含有TK、PK、gE、gI、gE和RR等非必需基因，大量研究表明删除这些基因并不影响PRV的复制，这些位点插入外源基因可以降低PRV的毒力，外源基因插入这些位点后可以得到稳定表达[1-6]。

人们先后构建了多种PRV减毒株[7-12]，如Bar⁃tha-K61株（gE-/gI-）、SA215株（TK-/gE-/gI-）、HB98株（TK-/gG-/gE-）、TK-/gE-/lacZ+株、TK-/gG-/lacZ+株、gE-株和gE-/gI-株等，均是理想的疫苗载体。方六荣等[13-15]先后报道了pIECMV、pgG-uni和pLR001通用载体，这些载体可以将外源基因插入伪狂犬病毒减毒株的基因组中，为构建重组伪狂犬病毒提供了有利工具。已构建了多种rPRV-EGFP载体[16-19]，为筛选重组伪狂犬病毒提供了方便。国内外学者报道了大量重组伪狂犬病毒疫苗，这些病原体包括刚地弓形虫、日本血吸虫、马尔他布鲁菌、猪园环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、日本脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪流感病毒、狂犬病毒和犬瘟热病毒等。

1 重组伪狂犬病毒抗寄生虫

1.1 刚地弓形虫

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，Tg）是弓形虫病的病原体,其表面抗原1（surface antigen 1，SAG1，又称P30）具有较强的免疫原性。将20 μg重组SAG1抗原加氢氧化铝佐剂皮下注射NMR1鼠，可有效对抗弓形虫RH株包囊的攻击[20]。Liu等[21]将SAG1基因插入p8KD得p8KD-SAG1，加入Bartha K61减毒株共同转染Vero细胞株，筛选重组病毒；用免疫印迹检测显示重组病毒表达的SAG1蛋白可被阳性血清特异识别；将6×105PFU重组病毒疫苗肌肉注射免疫BALB/c鼠，ELISA检测表明血清IgG在免疫后1～5周升高，免疫后3周达较高水平；细胞学试验显示在免疫后4周脾细胞增殖，脾CTL反应升高；此时用50个RH株速殖子进行腹腔注射攻击，攻击后4周免疫组的保护力为100% （5/5），而对照组为0（0/5）。

微线体蛋白 3（microneme proteins 3，MIC3）主要存在于弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子等期，研究表明它含有5个表皮生长因子样结构域和一个几丁质连接样结构域，在弓形虫识别、黏附和侵入细胞过程中起主要作用。将pCD-MIC3免疫CBA/J鼠可有效对抗弓形虫76K株包囊的口服攻击[22]。Nie等[23]将MIC3基因插入pgG-Uni得pgG-MIC3，加TK-gG-EGFP+减毒株共同转染PK15猪肾细胞株，筛选重组病毒；免疫印迹表明重组病毒表达的MIC3蛋白可被阳性血清所识别；将106TCID50重组病毒采用肌肉注射途径接种BALB/c鼠，初次免疫后4周加强1次，ELISA表明血清IgG在初次免疫后2～8周升高，初次免疫后8周达较高水平，血清中和抗体在初次免疫后6～8周的滴度为1∶64；脾细胞检测显示初次免疫后8周脾细胞增殖，并分泌高水平的IFN-γ、IL-2和IL-10等细胞因子；此时用100个Tg速殖子进行腹腔注射攻击，攻击后4周免疫组的存活率为50% （3/6），而对照组为0。

1.2 日本血吸虫

日本血吸虫（Schistosoma japonicum，Sj）可引起血吸虫病，Sj谷胱甘肽-S转移酶（Sj glutathi⁃one-S-transferase，Sj26GST）和Sj脂肪酸结合蛋白（Sj fatty acid bingding protein，SjFABP）是2种有希望的疫苗分子。李建国等[24]将重组质粒pCDSj26GST-SjFABP肌肉注射免疫BALB/c鼠，可对抗日本血吸虫尾蚴的攻击。Wei等[25]以pVAX-Sj26-Sj14为模板扩增Sj26-Sj14基因，插入p8KD得p8KD-Sj26-Sj14，加Bartha K61减毒株转染Vero株，筛选重组病毒，免疫印迹发现患者血清识别40 000的融合蛋白；将1.2×106PFU重组病毒采用肌肉注射途径接种绵羊，初次免疫后3周加强1次，ELISA显示血清IgG在初次免疫后3～6周升高，初次免疫后6周达较高水平；脾细胞检测表明在初次免疫后6周增殖，分泌高水平的IFN-γ，但不分泌IL-2、IL-4和IL-10，初次免疫后7周腹部贴皮感染40条Sj尾蚴，在攻击后6周免疫组的减虫率和减卵率分别为48.5% 和62.0% 。

2 重组伪狂犬病毒抗马尔他布鲁菌

马尔他布鲁菌（Brucella melitensis）可引起布氏杆菌病，又称波浪热。BP26是一种高度保守的蛋白质，将其免疫小鼠可减少细菌的攻击[26-27]。Yao等[28]以马尔他布鲁菌的M5株基因组DNA为模板扩增753 bp的BP26基因，插入pIECMV得pIE-bp26，加PRVΔgEΔTK减毒株转染PK-15株，筛选重组病毒，免疫印迹发现患者血清识别54 000的BP26蛋白；将1×105TCID50重组病毒采用肌肉注射方法免疫BALB/c鼠，初次免疫后2周加强1次，ELISA表明血清IgG在初次免疫后4～6周升高，初次免疫后6周达较高水平；血清中的中和抗体在初次免疫后6周升高6倍；脾细胞在初次免疫后6周增殖，脾IFN-γ+SFCs的数目增加。

3 重组伪狂犬病毒抗病毒

3.1 猪园环病毒Ⅱ型

猪园环病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type2，PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病原体。PCV2基因组存在2个开放读框（ORF），其中ORF1编码复制相关蛋白（replication-related protein，Rep），ORF2编码衣壳蛋白（capsid pro⁃tein，Cap），可自身聚合为病毒样颗粒。Rep和Cap可诱导仔猪产生中和抗体[29]。琚春梅等[30-31]以pT-PCV为模板扩增730 bp的ORF2基因，插入pgG-uni得pgG-ORF2，加PRV/TK-/gG-/lacZ+减毒株共同转染IBRS-2细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别28 000的ORF2蛋白；将105TCID50重组病毒采用肌肉注射方法接种BALB/c鼠，首次免疫后4周加强1次，ELISA表明血中和抗体在首次免疫后3～8周升高，首次免疫后8周达较高水平；在首次免疫后8周肌肉注射104TCID50伪狂犬病毒Ea株进行攻击，攻击后2周免疫组的存活率为100% （6/6），而对照组为0（0/6）。

宋云峰等[32]以PCV2基因组DNA进行PCR扩增705 bp的ORF2，插入pMD18-T得pT-ORF2，与pIECMV重组得pIE-ORF2，加PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株共同转染IBRS-2细胞，筛选重组病毒，South⁃ern印迹发现ORF2基因插入重组病毒的基因组中，但未进行保护力试验。钞安军等[33]将702 bp的ORF2基因插入pG得pG-ORF2，加HB98减毒株转染猪睾丸细胞株ST，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别27 800的ORF2蛋白；将1×106PFU重组病毒采用肌肉注射途径免疫昆明种小鼠，初次免疫后4周加强1次，ELISA显示免疫鼠血清IgG在初次免疫后5～8周升高，初次免疫后8周达较高水平；脾细胞检测表明在初次免疫后8周增殖，此时用1×106PFU猪园环病毒Ⅱ型NY株腹腔注射攻击，攻击后3周取肺，用RT-PCR扩增1767 bp的PCV2特异片段，发现免疫组的保护力为80% （8/10），而对照组为0（0/10）。

IL-18是一种细胞因子佐剂，可促进免疫应答。Zhang等[34]将702 bp的ORF2基因插入pG得pG-ORF2，将579 bp的IL-18基因插入pG-ORF2得pG-ORF2-IL-18，加HB98减毒株转染PK15株，然后进行重组病毒的筛选；从重组病毒抽提基因组DNA，以其为模板进行PCR可扩增出702 bp的ORF2和579 bp的IL-18基因；将107TCID50重组病毒皮下注射BALB/c鼠，初次免疫后2周加强1次，ELISA表明血中和抗体在初次免疫后2～8周升高，初次免疫后8周达较高水平；脾细胞检测显示在初次免疫后8周增殖；FACS发现脾CD4+和CD8+T细胞数目增加，此时皮下注射106TCID50的猪园环病毒Ⅱ型HN株进行攻击，攻击后3周取肺，发现免疫组的肺病毒负荷下降3×104倍。

Ju等[35]以Yu-A株基因组DNA为模板扩增960 bp的ORF1和600 bp的ORF2，将ORF1插入pIECMV得pIE-ORF1，再将ORF2基因插入pIEORF1 得 pIE-ORF1-ORF2，加 PRVΔTKΔgEΔgI减毒株转染猪肾细胞株IBRS-2，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别58 000的融合蛋白；将105TCID50重组病毒肌肉注射28 d龄仔猪，初次免疫后4周加强1次，初次免疫后6周发现血清IgG升高，外周血单核细胞增殖。将105TCID50重组病毒肌肉注射BALB/c鼠，初次免疫后4周加强1次，发现血清中和抗体在初次免疫后3～8周升高，初次免疫后6周达较高水平，初次免疫后8周发现脾细胞增殖，此时肌肉注射106TCID50伪狂犬病毒Ea株进行攻击，攻击后2周发现免疫组的存活率为100% （6/6），而对照组为0（0/6）。

3.2 猪细小病毒

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是初孕母猪繁殖障碍综合征的病原体之一。VP2是一种结构蛋白，可自身折叠为VLPs，将其免疫仔猪可诱导有效的保护力[36-37]。Chen等[38]将VP2基因插入pPI-2EGFP得pPI-VP2，加SA215减毒株转染Vero细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别93 000的VP2蛋白；将5×105TCID50重组病毒肌肉注射6月龄初孕母猪，血清中和抗体在免疫后4～16周升高，免疫后16周达较高水平，在免疫后11周静脉注射106.5TCID50猪细小病毒SC1株进行攻击，免疫组的分娩后仔猪死亡率为3.6% （1/28），而对照组为22.6% （7/31）。

吕建强等[39]以PPV的RF株基因组DNA为模板扩增VP2基因，插入pMD18-T得pMD-VP2，与pUSK重组得pUSK-VP2，加PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株共同转染PK-15细胞，然后进行重组病毒的筛选，免疫印迹表明重组病毒表达的64 000的VP2蛋白可被阳性血清所识别。付朋飞等[40]将VP2基因插入pG得pG-VP2，加HB98减毒株转染猪睾丸细胞ST，进行重组病毒的筛选，免疫印迹表明重组病毒表达的64 000的VP2蛋白可被阳性血清识别；将1×106PFU重组病毒采用肌肉注射方法接种昆明鼠，初次免疫后2周加强1次，ELISA表明血清中和抗体在初次免疫后1～7周升高，初次免疫后7周达较高水平；FACS显示在初次免疫后7周，脾CD4+和CD8+T细胞数目增加，此时皮下注射102.95TCID50伪狂犬病毒NY株进行攻击，攻击后3周免疫组的存活率为100% （5/5），而对照组为 0（0/5）。

3.3 日本脑炎病毒

日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是日本脑炎的病原体。膜前蛋白（premem⁃brane protein，PrM）、外膜蛋白（envelope glycopro⁃tein，E）及非结构蛋白 1（nonstructural protein 1,NS1）均是糖基化蛋白，将它们的DNA疫苗免疫小鼠和仔猪可产生一定的保护力[41-42]。李自力[43-44]以JEV的SA14-14-2株总RNA为模板扩增558 bp的PrM基因，插入pgG-uni得pgG-prM，加PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株共同转染PK-15细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现患者血清识别19 000的PrM蛋白；将105.0TCID50重组病毒采用足垫注射方法接种BALB/c鼠，首次免疫后4周加强1次，在首次免疫后6周发现血中和抗体滴度为1∶160，血PBMC的CTL活性升高，此时肌肉注射105.0TCID50伪狂犬病毒鄂A株进行攻击，攻击后2周免疫组的存活率为100% （8/8），对照组为0（0/8）。

Xu等[45]以JEV SA14-14-2株总RNA为模板扩增1.2 kb的NS1基因，插入pMD-18T得pMDNS1，与pUSK重组得pUSK-NS1，加PRV减毒株转染仓鼠肾细胞株BHK-21，筛选重组质粒，免疫印迹发现阳性血清识别46 000的NS1蛋白；将105PFU重组质粒肌肉注射BALB/c鼠，免疫后1周肌肉注射106.5PFU伪狂犬病毒Ea株进行攻击，攻击后2周免疫组的存活率为100% （10/10），而对照组为 0（0/10）。

Qian等[46]将PrM-E融合基因插入pCAGGS得pCAGGS-prM-E，与pIECMV重组得pIE-prM-E，加PRVΔTKΔgE减毒株转染PK-15株，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别19 000的PrM蛋白和53 000的E蛋白；将1×106TCID50重组病毒采用肌肉注射途径免疫BALB/c鼠，初次免疫后4周加强1次，ELISA显示血清中和抗体在初次免疫后2～8周升高，初次免疫后6周达较高水平，在初次免疫后8周发现脾细胞分泌高水平的IFN-γ，此时腹腔注射1×107PFU日本脑炎病毒SX09S-01株进行攻击，攻击后10 d免疫组的存活率为80% （8/10），而对照组为10% （1/10）。

3.4 猪瘟病毒

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）是猪瘟的病原体，外膜糖蛋白E2（envelope glco⁃protein 2，E2）是一种有效的免疫原，将重组Ad-E2免疫仔猪可对抗CSFV的攻击[47]。Wang等[48]将CMV-E2基因插入p0K-LR得p0K-CMV-E2，加Bartha-K61减毒株转染Vero细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别50 000的E2蛋白；将106TCID50重组病毒采用肌肉注射途径接种6周龄仔猪，初次免疫后3周加强1次，ELISA表明血中和抗体在初次免疫后2～5周升高，初次免疫后5周达较高水平，滴度为1∶32；在初次免疫后5周肌肉注射106TCID50猪瘟病毒shimen株进行攻击，攻击后2周免疫组的存活率为100% （5/5），而对照组为 0（0/5）。Lei等[49]将 104、105和 106TCID50的重组病毒肌肉注射仔猪，首次免疫后3周加强1次，首次免疫后6周发现各组血中和抗体分别为 1∶152、1∶360和 1∶737，此时肌肉注射 106TCID50猪瘟病毒shimen株进行攻击，攻击后2周取血和鼻拭子，RT-PCR查猪瘟病毒的特异靶基因，发现各组的病毒排出率为60% （3/5）、0（0/5）和0（0/5），各组的存活率分别为60% （3/5）、100% （5/5）和100% （5/5）。

3.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproduc⁃tive and respiratory syndrome virus，PRRSV）基因组的ORF5和ORF6分别编码包膜糖蛋白GP5和非糖基化膜蛋白M，在病毒颗粒中通常以异二聚体形式存在。将GP5/M的DNA疫苗免疫仔猪可诱导中和抗体，有效对抗PRRSV的攻击[50-51]。钱平等[52]以PRRSV的总RNA进行RT-PCR扩增765 bp的GP3基因，插入pgG-uni得pgG-GP3，加PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株，共同转染PK-15细胞筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别43 000的GP3蛋白。方六荣等[53]以pMD-ORF5扩增607 bp的ORF5基因，插入pgG-uni得pgG-ORF5，加PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株共同转染PK-15细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别25 000的GP5蛋白；将106TCID50重组病毒皮下注射免疫BALB/c鼠，首次免疫后4周加强1次，ELISA显示在首次免疫后8周血中和抗体不升高。

ORF5m表位是在ORF5的N端覆盖表位与中和表位之间插入通用Th细胞表位PADRE形成的，该表位编码GP5m蛋白。牛疱疹病毒Ⅰ型有一种VP22蛋白，具有独特的蛋白转导功能，可提高与之整合的外源蛋白的递呈效率，增强免疫原性。江云波等[54]以PRRSV基因组DNA为模板扩增650 bp的ORF5m基因，插入pMD18-T得pMDORF5m，与pIECMV重组得pIE-ORF5m，加PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株共同转染IBRS-2细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别27 000的ORF5m蛋白；将1×105TCID50重组病毒用肌肉注射方法接种BALB/c鼠，首次免疫后4周加强1次，首次免疫后10周发现血清IgG升高，滴度1∶16，脾细胞增殖。赵武等[55-56]分别以pIECMV-ORF5m、pCMVRA-ORF6和pMRVP22为模板扩增650 bp的ORF5m、550 bp的ORF6和780 bp的VP22基因，将它们分别插入pIECMV的相应位点构建pIE-VP22/ORF5m/ORF6，加PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株共同转染IBRS-2细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别60 000的VP22-E和52 000的VP22-M蛋白；将105TCID50重组病毒采用肌肉注射途径接种BALB/c鼠，首次免疫后4周加强1次，ELISA表明在首次免疫后10周血清中和抗体滴度为1∶32～1∶64，脾细胞增殖。田志军等[57]将 pUC-GP5与pBdTK-Uni重组得pUni-GP5，与pBS-lacZ重组得pGP5-lacZ，加PRV减毒株转化Vero株，进行重组病毒的筛选，免疫印迹表明重组病毒表达的34 000的GP5蛋白可被阳性血清识别；将1×107PFU重组病毒滴鼻免疫小猪，初次免疫后4周肌肉注射1×107PFU重组病毒进行加强，初次免疫后9周血中和抗体升高，此时用105TCID50猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株进行滴鼻攻击，攻击后1周免疫组的存活率为100% （4/4），对照组为0（0/3）。

Qiu等[58]将pGP5-lacZ与pSTK重组得pGP5K-lacZ，加Bartha-K61减毒株转染Vero细胞株，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别38 000的GP5融合蛋白；将107PFU重组病毒肌肉注射4周龄仔猪，免疫后4周用106.5TCID50猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株进行滴鼻攻击，攻击后4周免疫组临床症状好转，肺病理减轻，血IgG升高，肺组织无病毒负荷。Jiang等[59]将GP5基因插入pIECMV得pIE-GP5，将M基因插入pIE-GP5得pIE-GP5-M，加PRVΔTKΔgE减毒株转染IBRS-2细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别48 000的GP5-M融合蛋白；将1×106PFU重组病毒肌肉注射4周龄仔猪，初次免疫后4周加强1次，初次免疫后6周血中和抗体升高，脾细胞增殖，初次免疫后9周用5×105TCID50猪繁殖与呼吸综合征病毒YA1株进行滴鼻攻击，攻击后3周取肺，RT-PCR扩增PRRSV的ORF-7基因，发现免疫组肺病毒负荷为0（0/5），而对照组为100% （5/5）。

3.6 口蹄疫病毒

口蹄疫病毒（Foot andmouth disease virus，FMDV）可引起家畜的口蹄疫。P1-2A是FMDV的壳蛋白前体，在蛋白水解酶3C作用下裂解为VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1和VP2含有许多细胞表位，将它们的DNA疫苗免疫仔猪、小鼠或豚鼠均可产生保护性免疫反应[60-61]。金梅林等[62]以pMD-P1为模板扩增P1基因，插入pgG-uni得pgG-P1，加PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株共同 转染PK-15细胞，进行重组病毒的筛选，免疫印迹发现阳性血清识别80 000的P1蛋白。寇叙等[63]以FMDV基因组DNA为模板扩增VP1基因，插入pEGFP-CI得 pEGFP-VP1，与 pPolyⅡ-PRVΔPK 重组得 pPRVΔPK-VP1，加 PRV/TK-/gE-/lacZ+减毒株共同转染PK-15细胞，进行重组病毒的筛选，RTPCR发现从重组病毒抽提的总RNA可扩增出823 bp的VP1基因。Hong等[64]将P1-2A基因插入pIECMV得pIE-P1-2A，将VP2基因插入pIE-P1-2A得pIE-P1-2A-VP2，加PRV减毒株转染PK-15株，进行重组病毒的筛选；从重组病毒抽提基因组DNA，以其为模板进行PCR可扩增出2.3 kb的P1-2A和0.44 kb VP2基因；将1×105TCID50重组病毒采用肌肉注射途径接种BALB/c鼠，初次免疫后4周加强1次，ELISA表明血中和抗体在初次免疫后2～8周升高，初次免疫后6周达较高水平，在初次免疫后8周肌肉注射107TCID50伪狂犬病毒Ea株进行攻击，攻击后3周免疫组的存活率为100% （8/8），而对照组为0（0/8）。

FHG是一个复合表位基因，含6个VP2的B细胞表位、1个VP1的T细胞表位和1个3A的T细胞表位。He等[65]将FHG基因插入pIECMV得pIEFHG，将P1基因插入pIE-FHG得pIE-FHG-P1，加PRVΔTKΔgG减毒株转染IBRS-2细胞，筛选重组病毒，Southern印迹证实2.3 kb的FHG-P1基因整合入PRV基因组中；将1×105TCID50重组病毒肌肉注射5周龄仔猪，初次免疫后4周加强1次，在初次免疫后8周血中和抗体升高，PBMC明显增殖。Zhang等[66]将P12A3C基因插入pIECMV得pIEP12A3C，加PRVΔTKΔgG减毒株转染IBRS-2株，筛选重组病毒，免疫荧光发现重组病毒表面存在融合蛋白分子；将106TCID50重组病毒肌肉注射6周龄仔猪，初次免疫后3周加强1次，发现血中和抗体和PBMC在初次免疫后2～3周升高，初次免疫后15周达较高水平，在初次免疫后5周肌肉注射103ID50FMDV进行攻击，攻击后10 d免疫组的存活率为60% （3/5），而对照组为0（0/5）。

3.7 猪流感病毒

猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）是猪流感的病原体，其RNA第5节段编码的血凝素（hemagglutinin，HA）是一种主要表面糖蛋白，将其DNA疫苗免疫仔猪可对抗SIV攻击[67]。李敏等[68]以SIV基因组DNA为模板扩增H1A基因和H3A基因，将H1A插入pIRESneo得pIRES-H1A，与pUC-TK重组得pUC-P-H1A，将H3A插入pUC-PH1A得pUC-P-H1A-H3A，加PRV减毒株共同转染Vero细胞，然后进行重组病毒的筛选，免疫印迹表明重组病毒表达的60 000的HA蛋白可被阳性血清识别。

Klingbeil等[69-70]人工合成密码子优化的HAsyn和NAsyn，分别插入pCDNA3-1得pCD-HAsyn/NAsyn，与 pRRV-BaΔgGG 重 组 得 pPRV-HAsyn/NAsyn，加PRV减毒株共同转染PK13细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别75 000的HA和70 000的NA蛋白；将2×107PFU重组病毒肌肉注射仔猪，首次免疫后3周加强1次，在首次免疫后6周发现血IgG升高，FACS证实血PBMC中激活B细胞（CD3-CD2-CD21+）和记忆B细胞（CD3-CD2-CD21-）的数目均明显增加，此时用2×106TCID50猪流感病毒H1N1株进行滴鼻攻击，攻击后2～4 d取血和鼻拭子，RT-PCR扩增H1N1株的M基因，发现免疫组的病毒负荷下降1～2个数量级。

Tian等[71]将HA基因插入pBdTK-Uni得pUni-HA，与 pBS-lacZ重组得 pLTK-HA，加 PRV Bar⁃tha-K61株转染PK-15株，筛选重组病毒，免疫印迹发现阳性血清识别60 000的HA蛋白；将1×105PFU重组病毒采用滴鼻途径接种BALB/c鼠，ELI⁃SA显示血清IgG在免疫后1～4周升高，免疫后3周达较高水平，在免疫后4周用1×105TCID50猪流感病毒H3N2株进行滴鼻攻击，攻击后2周取肺，免疫组的肺组织病毒负荷为0，肺组织病变减轻。

3.8 狂犬病毒

狂犬病毒（Rabies virus）是狂犬病的病原体，狂犬病毒的糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RGP）具有较强的免疫原性[72]。Yuan等[73]将RGP基因插入peGFPC1得peGFP-RGP，与p8AA重组得p8AA-RGP，加PRV减毒株转染BHK-21细胞，进行重组病毒的筛选，免疫荧光发现特异荧光抗体识别重组病毒表达的融合蛋白分子；将2×107PFU重组病毒免疫比格犬，发现血清中和抗体在免疫后2～26周升高，免疫后6周达较高水平，滴度 为 1∶128。 袁子 国 等[74]将 103、104、105和 106TCID50重组病毒经由肌肉注射分别免疫比格犬，免疫后5周血中和抗体的滴度分别为1∶23、1∶30、1∶48和1∶53，此时皮下注射6×104LD50狂犬病毒CVS-11株进行攻击，攻击后30 d各组的存活率分别为50% （5/10）、60% （6/10）、100% （10/10）和100% （10/10），而对照组为0（0/10）。

3.9 犬瘟热病毒

犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）的H基因编码的糖蛋白H在该病毒的融合、生长和细胞嗜性等方面具有重要作用，将其DNA疫苗免疫幼犬可诱导较强的保护力[75]。李业伟等[76]将pMD-H与pDNA3.1重组得pCD-H，与p8AA重组得p8AA-H，加PRV减毒株共同转染BHK21细胞，筛选重组病毒，免疫电镜发现直径22 nm的阳性病毒颗粒。

4 结语

伪狂犬病毒的宿主范围广，不感染人体，可减少不必要的公众恐慌；其基因组的结构稳定，遗传背景清晰，无致癌性；基因组可插入大于10 kb的外源基因，能够稳定表达，可诱导宿主产生记忆性T细胞，产生长期免疫应答；重组伪狂犬病毒可以口服和滴鼻接种，简便有效；但伪狂犬病毒的早期感染可能干扰重组伪狂犬病毒的复制，降低疫苗的免疫效率，影响加强免疫，可先用DNA免疫，再用重组PRV疫苗加强克服其不足。

随着现代生物科技的发展，伪狂犬病毒的基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学及表观遗传学已得到比较广泛和深入的研究，这对于弄清伪狂犬病毒抗原结构与功能的关系具有重要意义，有助于筛选新的抗原分子，从而构建由各期抗原分子组成的多期多价疫苗。须进一步探讨它们的免疫原性、转化效率、MHC限制性以及能否长期在宿主体内表达，研制新型佐剂、疫苗载体和制备融合抗原也势在必行。还须积极探索重组伪狂犬病毒的免疫剂量、免疫次数、免疫间隔时间和免疫接种途径等，而阐明这些问题必将推动重组伪狂犬病毒疫苗的研究势头。