氦氖激光对退变颞下颌关节髁突软骨基质与基质调节因子表达的影响

毛凯平　邹璟　李解　姜梦雅　高桃珍　黄国付

颞下颌关节骨关节病(temporomandibular joint osteoarthrosis, TMJOA)是颞下颌关节组织发生磨损与变形，在关节表面形成新骨的非炎症性骨关节病。颞下颌关节结构与功能复杂，加之人的一生中型不断发生改变，颞下颌关节经历了复杂的改建过程，以致其发病率高达30%，严重影响患者的生活质量[1]。

研究证实，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分改变是关节软骨退行性改变的重要原因，颞下颌骨关节病的发生即为髁突软骨细胞所控制的ECM合成、分解代谢失衡所致[2]。氦氖激光是临床治疗TMJOA的常用手段之一，但其作用机制尚不完全清楚，本文通过研究氦氖激光对退变颞下颌关节细胞外基质胶原2(Col-2)、蛋白多糖4(PRG4)和基质调节因子基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)、基质金属蛋白酶-1组织抑制因子(tissue-inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表达的影响，以期明确氦氖激光对颞下颌关节退变的保护作用与机制。

1　资料与方法

1.1　动物与分组

健康成年雄性新西兰大白兔40 只，月龄5～6 月，体重2～2.5 kg，无牙颌畸形，由武汉大学实验动物中心提供(合格证号： 42000500002225)，在标准条件下(武汉市第一医院中心实验室)适应性饲养3 周后开始实验，实验过程中的程序经过了武汉市第一医院实验动物伦理委员会审批。所有动物进行编号，查随机数字表分为4 小组。每组10 只，分为2 个时间点，即造模后1、 11 d，每个时间点各5 只。

①正常组(control,n=10)：自然饲养，不作任何治疗; ②模型组(TMJOA，n=10)：模型，不作任何治疗; ③假模型组(sham,n=10)：同模型组，但不切除关节盘，不作任何治疗; ④治疗组(HNL,n=10)：于造模后第1 天开始氦氖激光治疗，连续治疗10 d。

1.2　造模方法

参照常嘉等[3]的造模方法，建立单侧颞下颌关节骨关节病动物模型。于耳缘静脉注射1 mg/kg的2.5 g/L的戊巴比妥钠。无菌条件下自右侧眼外眦外侧5 mm处至外耳道方向行2 cm长的皮肤切口，分离皮下组织，暴露关节囊。水平切开关节囊，切开关节盘的外侧附着，将下颌升支推向外侧以充分暴露髁突关节面与关节盘。将关节盘前外1/2部分切除。无菌生理盐水充分冲洗后将剩余关节盘复位，分层缝合关节囊、皮下组织和皮肤。假模型组仅作关节囊切开后即缝合组织。术后不限制动物的下颌运动，饲养颗粒性常规兔饲料，单笼饲养。连续肌肉注射青霉素3 d，4 万单位/d。于术后1 个月行颞下颌关节CT检查，出现典型的TMJOA改变即进行后续实验，未出现TMJOA改变的动物予以剔除。

1.3　治疗方法

上海产MDC-500半导体激光治疗仪(MDC-500)，剂量参照Suri 等[4]运用激光治疗颞下颌关节紊乱病的参数，输出氦氖激光波长632.8 nm，功率10 mW，激光光针光斑直径2 mm。按照《实验针灸学》[5]及《动物针灸学》[6]教材进行动物穴位定位，取患侧颊车、上关、下关、听宫、翳风，光针紧贴皮肤并与之垂直，每穴照射5 min，共治疗10 d。

1.4　取材及Western Blot检测

在造模后第1 天，将各组10 只新西兰兔予以麻醉后行CT检查模型是否成功，出现OA改变的动物予以纳入模型组和治疗组，每组5 只，待苏醒后继续氦氖激光治疗10 d，模型未成功予以剔除后补充。在第1、11 天各取5 只，将实验动物以过量注射麻醉药方法处死，取各组髁突软骨，一部分放入4%多聚甲醛供HE染色，一部分直接冻存于-80 ℃冰箱待检测。

取出软骨后，迅速称重，然后将组织放入装有液氮的研钵中，利用研磨法将软骨磨成粉末状，收集到 1.5 ml的 EP 管中，在冰上裂解组织 30 min，离心 15 min，取上清，测定蛋白浓度。Western Blot方法进行检测Col-2、PRG-4、MMP-13、TIMP-1、BMP-2蛋白表达量：按蛋白分子量配制10%的PAGE胶电泳，根据预染marker显示，充分分离目的蛋白，取出凝胶用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。然后用含5% 脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h。再加入一抗孵育，TBST充分洗涤PVDF膜5～6 次，用封闭液稀释相应的HRP标记二抗(1∶40 000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，显色曝光。BandScan凝胶图像分析软件分析胶片灰度值。

1.5　统计学分析

2　结　果

2.1　模型兔颞下颌关节CT表现

本研究采用了成年新西兰大白兔作为实验对象，手术切除部分关节盘制造TMJOA模型。模型兔于术后1 月行三维CT检查，患侧下颌关节盘出现缺损，形态改变，骨质表面粗糙, CT平扫可见骨赘及关节结节形成，骨质增生明显(图 1)。

2.2　髁突软骨HE染色

正常髁突软骨分为纤维层、增殖层、过渡层及软骨层，HE染色发现假模型组与正常组基本无变化，退变髁突软骨纤维层可见纤维降解，红染减弱，细胞数量较正常减少，纤维层与软骨层之间距离变小，细胞核出现皱缩，核浓染，另外一些细胞甚至核仁的完全消失，软骨陷窝增大，留下白色细胞影态。经过氦氖激光治疗10 d后的软骨髁突较模型组相比，纤维层轻度松解，部分纤维合成，红染增强(图 2)。

2.3　氦氖激光治疗对细胞外基质和基质调节因子表达的影响

Western blot检测显示，正常组及假模型组不同时间点之间Col-2、PRG-4、MMP-13、TIMP-1、BMP-2蛋白表达差异无统计学意义；造模成功后第1 天时间点，模型组与治疗组MMP-13表达均明显升高，Col-2、PRG-4、TIMP-1、BMP-2表达均明显降低，与正常组和假模型组比较，差异均有统计学意义；模型组第11 天各基质调节因子与第1 天表达无统计学差异；治疗组第11 天与第1 天比较，MMP-13表达均明显降低，Col-2、PRG-4、TIMP-1、BMP-2表达均明显升高，且与模型组相比，差异均有统计学意义(图 3～4)。

A: 模型组健侧(左侧); B: 模型组TMJOA患侧(右侧)； C： CT平扫，黄色箭头为健侧(左侧)，蓝色箭头为患侧(右侧)

图 1TMJ 3D-CT图示

A： Left side as the contral; B: Right side with TMJOA; C: Plain scan CT image, yellow arrow: The contral(left), blue arrow: Right side with TMJOA

Fig 13D-CT manifestations of the TMJ

图 2兔髁突软骨(HE，×200)

Fig 2Histomorphology of the TMJ cartilage(HE, ×200)

图 3各组COL-2、PRG-4蛋白表达量(*: 与正常组及假模型组相比,P<0.05, 与模型组第11 天相比, #P<0.05)

Fig 3COL-2 and PRG-4 protein expression in the groups(*: Compared with the normal group and the sham model group,P<0.05; #: Compared with the 11 d time point in the model group,P<0.05)

图 4各组MMP-13、TIMP-1、BMP-2蛋白表达量(*: 与正常组及假模型组相比,P<0.05; #: 与正常组、假模型组及模型组第11 天相比,P<0.05)

Fig 4MMP-13， TIMP-1， BMP-2 protein expression in the groups(*: Compared with the normal group and the sham model group,P<0.05; #: Compared with the 11 d time point in the normal group， the sham model group and the model group,P<0.05)

3　讨　论

尽管颞下颌骨关节病的机制尚未完全阐明，但髁突软骨细胞对基质合成与分解代谢调控的失衡被认为是其主要病理环节。文献证实，髁突软骨细胞是关节软骨基质成分的惟一来源，颞下颌骨关节病的发生即为髁突软骨细胞所控制的合成、分解代谢失衡所致，其主要特征为关节软骨细胞外基质成分的进行性降解，同时伴随着继发性炎症因子的释放及其相关效应[2]。

临床观察表明，氦氖激光对颞下颌骨关节病具有良好的治疗作用[7]，已有研究显示，氦氖激光光针释放出的激光光子能量被病态的生物分子吸收后，可改变病态生物分子内能，这种改变相当于一种刺激源，可直接或间接兴奋神经、肌肉和腺体，同时， 可使钾离子致解反应时间显著延长，使五羟色胺物质明显降低，激活内源性吗啡样镇痛物质，延长感觉神经潜伏时间，整合中枢神经的痛觉信号，从而达到镇痛效果，并通过促进新生血管的形成改善颞下颌关节患者局部血液循环，通过抑制固有炎症介质PGE的合成及直接抗炎作用，降低炎症反应[8]。

正常的髁突软骨中含有大量含水的细胞外基质，这些细胞外基质的主要成分是Col-2以及少部分其他类型的胶原。Col-2是髁突软骨的主要结构成分，是形成细胞外软骨生物机械的重要支架，是胶原分子相互作用的关键，为软骨分化的主要特异性蛋白[9]。PRG-4是一种蛋白多糖，是关节液的重要组成部分，可介导边界润滑[10-12]，缓冲过大的关节负荷，降低盘突间的摩擦力，保护和修复软骨。关节软骨没有神经和血管，主要依靠关节液内PRG-4等蛋白的分泌维持自身的组织液动态平衡和自身营养，所以任何影响关节液分泌的因素都可能直接影响关节软骨的代谢。

MMP-13广泛存在于骨关节炎患者的关节软骨和滑膜中，被认为是细胞外基质分解代谢酶，是裂解Ⅱ型胶原作用最强的酶，主要降解Ⅱ型胶原为3/4和1/4片断[13-14]。TIMP是MMPs的特异性生理抑制剂，同时也是抗分解代谢酶，能够特异性抑制MMPs的活性，避免软骨基质裂解。TIMP-1与MMP-13之间动态的相互作用，在基质稳定的维持中发挥重要作用[15]。BMP-2作为细胞外基质合成代谢酶，不仅可促进软骨细胞的增殖与分化以及细胞外基质的合成[16-17]，还促进退变软骨中细胞的再生和合成代谢活动[18]；不仅参与正常颞下颌关节髁突的生长发育，而且对髁突适应性改建甚至损伤发挥重要作用[19]，这使其在骨关节病的临床治疗中具有极大的潜在应用价值[20-21]。

本研究发现，退变的颞下颌关节组织中，细胞外基质Col-2、PRG-4和基质调节因子TIMP-1、BMP-2蛋白表达较正常颞下颌关节明显降低，而基质调节因子MMP-13明显升高，证实了细胞外基质Col-2、PRG-4和基质调节因子TIMP-1、BMP-2蛋白表达的下降以及MMP-13蛋白表达升高是颞下颌关节骨关节病的重要机制之一。正常组与假模型组之间二者的表达无显著性差异，说明未切除关节盘的颞下颌关节模型无明显的退变。在治疗组中选用氦氖激光照射患侧颊车、上关、下关、听宫、翳风穴10 d后，颞下颌关节组织中Col-2、PRG-4和基质调节因子TIMP-1、BMP-2蛋白表达明显增加，基质调节因子MMP-13蛋白表达下降，表明氦氖激光治疗可上调退变颞下颌关节细胞外基质Col-2、PRG-4和基质调节因子TIMP-1、BMP-2蛋白表达，下调基质调节因子MMP-13表达，从而减少细胞外基质降解，增加其合成，纠正细胞外基质降解和合成之间的失衡，进而防治颞下颌关节骨关节病。本研究为临床运用氦氖激光治疗TMJOA提供了一定的理论依据，但氦氖激光影响相关蛋白表达的具体机制仍需进一步研究。

[1]方泽强, 马绪臣. 颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞线粒体DNA突变的实验研究[J]. 北京大学学报(医学版), 2006, 38(3): 293-297.

[2]常嘉, 马绪臣, 马大龙. 兔实验性骨关节病髁突软骨细胞表达软骨基质分子的变化及白细胞介素1β的影响[J]. 北京大学学报(医学版), 2003, 35(5): 521-524.

[3]常嘉, 马绪臣, 武登诚, 等. 颞下颌关节骨关节病动物模型的建立及组织病理学观察[J]. 现代口腔医学杂志, 2003, 17(6): 485-488.

[4]Suri S. Design features and simple methods of incorporating nasal stents in presurgical nasoalveolar molding appliances[J]. J Craniofac Surg, 2009, 20(2): 1889-1894.

[5]钟秀会， 董修建. 动物针灸学[M]. 北京：中国农业科技出版社， 2006： 192-214.

[6]郭义， 方剑乔. 实验针灸学[M]. 北京：中国中医药出版社，2012： 46-67.

[7]涂强. 氦-氖激光光针穴位照射治疗颞下颌关节功能紊乱综合征37例[J]. 中国医药指南, 2009, 7(24): 105-106.

[8]虞素芳, 刘翠云. 氦-氖激光治疗颞下颌关节紊乱综合征78例报告[J]. 激光杂志, 1989, 10(6): 289-290.

[9]夏欣一, 杨滨. COL2A1基因突变于Ⅱ型胶原病[J]. 中国优生与遗传杂志, 2008, 16(7): 3-8.

[10]冯剑颖, 谷志远, 林新平, 等. 兔关节盘前移位后髁突软骨PRG4mRNA表达改变的研究[J]. 口腔医学, 2010, 30(6): 324-327.

[11]魏红, 程杰, 王子露, 等. rhIL-1α/ rhTGF-β1诱导下大鼠髁突软骨细胞 PRG4的表达[J]. 实用口腔医学杂志, 2010, 26(6): 735-738.

[12]Kim HK, Moran ME, Salter RB, et al. The potential of regeneration of articular cartilage in defect created by chondra l shaving and subchondral abrasion An experimental investigation in rabbits[J]. J Bone Joint Surg Am, 1991, 73(9): 1301-1315.

[13]郭延伟, 房殿吉, 李松. 人参皂苷Rg1/ADSCs辅以透明质酸为基质对兔颞下颌关节骨关节病的改善作用[J]. 中国口腔颌面外科杂志, 2012, 10(4): 271-276.

[14]李新军, 胡开进, 王文勇. 间接性TMJ损伤后裸突软骨中MMP-13表达及其意义[J]. 口腔颌面外科杂志, 2003, 13(4): 283-286.

[15]于大海, 黄慧萍, 李煜. 改变食物负荷对大鼠断奶后颞下颌关节软骨MMP-8 和 TIMP-1 表达的影响[J]. 临床口腔医学杂志, 2010, 26(2): 70-73.

[16]De Luca F, Barnes KM, Uyeda JA, et al. Regulation of growth plate chondrogenesis by bone morphogenetic protein-2[J]. Endocrinology, 2001, 142(1): 430-436.

[17]Gründer T, Gaissmaier C, Fritz J, et al. Bone morphogenetic protein (BMP)-2 enhances the expression of type Ⅱ collagen and aggrecan in chondrocytes embedded in alginate beads[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2004, 12(7): 559-567.

[18]Nakase T, Miyaji T, Tomita T, et al. Localization of bone morphogenetic protein-2 in human osteoarthritic cartilage and osteophyte[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2003, 11(4): 278-284.

[19]赵东强, 王东, 邢晓伟. 功能负荷改变对兔髁突软骨中骨形成蛋白-2表达的影响[J]. 天津医科大学学报, 2011, 17(1): 24-26.

[20]秦霞南, 龙星, 李金荣. 颞下颌关节骨关节病的临床诊断[J]. 口腔医学研究, 2006, 22(2): 197-199.

[21]秦霞南, 龙星, 李金荣. 颞下颌关节骨关节病临床病理研究[J]. 口腔医学研究, 2005, 21(4): 440-442.