CYP17基因多态性与原发性卵巢功能不全的相关性研究

林晴 姚吉龙

原发性卵巢功能不全 (primary ovarian insufficiency，POI) 是指发育正常女性在40岁前因各种原因引起的卵巢功能提前衰退的疾病，表现为继发性闭经、低雌激素[雌二醇(estradiol,E2< 73.2 pmol/L) ]与高促性腺激素[卵泡刺激素(follicle stimulating hormon，FSH)>40 U/L]、高黄体生成素[(1uteinizing hormon，LH)>30 U/L) ][1]。POI病理基础为卵巢组织内卵泡几乎消耗殆尽，可表现为原发性或继发性闭经[2]。继发性闭经患者中POI发生率为4%～18%[3]。POI病因复杂，大部分病例找不到明确病因，称特发性POI。患者染色体检查正常，自身免疫抗体检查正常等，约占POI患者74%～90%.因病因不明给治疗带来困难。POI可发生在青春期前、青春期或生育期[4]。POI患者的卵巢组织学呈围绝经期或者绝经后改变。据统计，40岁前POI发病率约1%，30岁前发病率约0.1%，20 岁前发病率约0.01%[5]。据流行病学统计分析，POI有发病率上升、发病年轻化趋势。研究提示多种基因参加了POI调节，细胞色素P450C17 酶(cytochrome P450 17 hydroxylase，CYP17)基因多态性和多种雌激素(estrogen E)有关疾病相关，CYP17是雌激素合成与代谢中的关键酶，它的基因的多态性可能改变了酶含量与酶活性进而影响到雌激素的代谢与生物学效应，导致内分泌激素紊乱[6]，正常月经周期改变，发展到闭经，严重者发生POI。本文拟了解CYP17基因与POI之间的关系，进而为研究POI患者个体化治疗和预后提供依据。

对象与方法

1.对象：选择2014年2月至2015年9月在深圳妇幼保健院妇科门诊诊断的无明确病因的POI女性132例为病例组。病例组同时要满足以下标准，即(1)年龄小于40周岁，有4个月经周期或以上无月经来潮；(2)大于等于两次空腹血清FSH > 40 U/L (需间隔1个或以上周期)；(3)血清催乳素(prolactin，PRL)正常；(4)需排除染色体异常、免疫、感染、放化疗等导致疾病的原因。对照组是同 一个时期由于其他病因就诊的、年纪相当、月经规则、性激素检查无异常、彩超显示卵巢大小形态正常的132例患者。两组患者年龄、初潮年龄、BMI的比较差异均无统计学意义，两组FSH、E2、LH差异均有统计学意义。见表1。

表1 两组患者的一般资料比较

注：*P<0.05

2.实验方法：病例组要求1个月内未使用激素类药物，早晨空腹抽取肘静脉血，对照组则于月经周期的第3天早晨空腹抽取肘静脉血。予枸橼酸钠抗凝管取5ml静脉血，置于-70℃超低温冰箱。提取保存的外周静脉血0.5 ml，种在RPMI1640的培养基里，经过一系列处理，用相关分析软件[DNA序列读取软件：Chromas(version2.41); 凝胶成像、扫描分析软件和其他软件:Grab-IT 2.UVP Gelworks ID advanced version 2.5等]行核型的分析研究。另外取外周静脉血1ml进行免疫全套检测、甲状腺功能检查等。在本院中心实验室里用间接免疫荧光的方法检测抗Sm抗体、抗卵巢抗体(AOAb)、抗Jo-1抗体、抗核抗体(ANA)、抗SCL-70抗体、抗ssA抗体等。实验用饱和酚/氯仿法，获得目的基因DNA片段。使用紫外分光光度计来进行分别测量OD260及OD280，算出DNA浓度及OD260/OD280的比值。选取基因组的DNA浓度范围是10～200 ug/ml，OD260/OD280的范围是1.6～1.9。在NCBI网站的数据库查找到CYP17基因的SNPs的有关的序列，选择CYP17基因外显包子，应用引物设计的软件设计正反向引物，进行扩增CYP17基因外显子，含外显子的编码区及有关侧翼序列。见表2。

表2 CYP17基因引物的详细信息及相应的退火温度

注：NA表示不适用

3.统计学处理：用SHEsis软件来进行单个多态位点基因型频率及等位基因频率统计，对于基因型、等位基因型的频率，分别行病例组、对照组的卡方检验，应用SPSS19.0统计分析软件。对于以前有报道的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)，用卡方检验分析。研究CYP17基因在不同的人群里的分布状况。所有P值均基于双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义，若为多重检验行Bonferroni校正。

结果

用综合性序列分析软件包(DNAStar软件包)、序列对比软件(Seqman软件)对病例组和对照组的CYP17基因PCR扩增产物测序结果进行拼接与对比分析。所得结果与美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的SNPs数据库已记录的SNPs比较。提示在病例组和对照组里面都检测到了CYP17基因突变位点。一共发现6个SNPs，均是二等位基因型。其中转换为6个(2个为A/G，3个为T/C，1个为G/A)。病例组和对照组外周血CYP17基因的测序中发现的6个SNPs里面，其中有两个是新发现，即内含子G-14A及外显子c.61 G>A，其余4个则是NCBI的SNPs数据库中已有记录的。见表3。

所有6个SNPs中，基因频率测定结果显示CYP17基因的SNPs中4个是常见的SNPs，次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)都大于5%，2个是罕见的SNPs。对病例组和对照组中CYP17基因的6个SNPs进行统计学分析，发现rs1004467、c.666+35T>C的等位基因频率和基因型频率在两组间差异无统计学意义，rs743572(T-34C)、rs6162(c.138C>T)、rs6163(c.200G>T) 的等位基因频率和基因型频率在两组间差异具有统计学意义。见表4、表5。

表3 病例组与对照组检测到的CYP17基因序列的变异

注：NA表示不适用

表4 CYP17基因突变位点的基因型和等位基因型频率统计分析

注：两组等位基因型和基因型频率分别比较，*P<0.05

表5 POI患者CYP17基因型二分类条件Logistic 回归分析

讨论

POI是指在40岁之前便出现了闭经、促性腺激素的升高、雌激素的缺乏。迄今仍无统一的国际公认的诊断标准[7]。卵巢反应不良(POR)是指在辅助生殖技术实行的过程中，卵巢对促性腺激素的刺激反应不良状态。多数的表现是卵巢所刺激周期发育卵泡减少，获得卵子数目减少、临床上的妊娠率降低。POI、POR提示妇女生殖能力降低乃至丧失。所以,及早发现这一类的女性，给予适当的激素替代治疗是现在辅助生殖的一个重要领域。2011年由人类生殖与胚胎协会第一次提道POR博洛尼亚国际的诊断标准[8]。可是这个标准的必要条件、截断值和按照这个标准纳入的人群一致性均存在缺点，所以仍需进一步的大样本的临床随机对照研究予以验证[9]。

POI、卵巢储备功能不良(DOR)进一步发展，最后是卵巢功能衰竭，DOR如过提前发生就是卵巢早衰(POF)。POF在大部分的人群中发病率是1%～3%[10]。POF提示了妇女失去了生育的能力。因此在POI阶段，就需重视挽救生殖能力、解决生育问题。卵巢功能衰竭之后，重点转到了维持身体的良好状态。卵巢功能减退、卵巢早衰的诊断标准的明确对尽早发现这一类女性有帮助，可早期的给予相对应的对策，尽量完成这类患者的生育梦、确保她们的身心健康。

迄今有关CYP17基因多态性和雌激素有关的疾病研究中结论不同。可能与CYP17基因型的分布频率在不同的种族、地区有差异。且和试验标准、使用方法不同可能有关。CYP17酶在雌激素的合成、代谢阶段有不同的作用。现在研究CYP17基因多态性与患乳癌风险的关系广泛。最近有学者开始研究CYP17基因与子宫内膜癌或卵巢癌的关系。但目前为止仍无关于CYP17基因和POI关系的报道。

本文使用DNAStar软件包中的Seqman软件对病例组和对照组的CYP17 PCR扩增产物测序结果次序进行拼接与比对分析，得到的结果和NCBI的SNPs数据库已记录的SNPs进行比较，结果显示在病例组与对照组中均检测到CYP17基因的突变位点，共发现了6个SNPs，都为二等位基因型。转换6个(2个A/G，3个T/C，1个G/A)。病例组与对照组外周血CYP17基因的测序发现的6个SNPs中2个为新发现，为内含子G-14A和外显子c.61 G>A，4个为NCBI的SNPs数据库中已有记录。

对病例组和对照组发现的CYP17基因的6个SNPs进行统计学分析，发现Rs1004467、c.666+35T>C的等位基因频率和基因型频率在病例组和对照组间无统计学意义，而rs743572(T-34C)、rs6162(c.138C>T)、rs6163(c.200G>T) 的等位基因频率和基因型频率在病例组和对照组间差异有统计学意义。

使用二分类Logistic 回归计算分析CYP17基因的rs743572(T-34C)、rs6162(c.138C>T)、rs6163(c.200G>T) 的3个突变位点，为POI的发病危险因素，结果显示CYP17基因的rs743572(T-34C)、rs6162(c.138C>T)、rs6163(c.200G>T) 的3个突变位点，在病例组和病例组对照组之间有差异有统计学意义。

综上所述，CYP17基因突变可能在中国汉族人群POI病因学方面起作用。从酶的相关作用机分子生物学角度来探讨CYP17基因的多态性，影响到雌激素代谢和卵巢功能，从而找到发生POI的潜在的高危因素。这样就有可能经过检测出妇女人群里的CYP17基因型来进行进一步的筛查分类、强化随访，为及早预防POI的发生提供有力的理论上依据，还可使雌激素在激素替代治疗中的安全性得到评估。

1 谢幸,苟文丽,妇产科学.第八版.人民卫生出版社,2014:354.

2 曹泽毅．中华妇产科学．第2版．北京：人民卫生出版社，2004：2565-2568．

3 Laml T,Schlz-Lobmeyr I,Obruca A,et al.Premature ovarian failure:etiology and prospects.Gynecol Endocrinol,2000,14:292-302.

4 Kalantaridou SN,Davis SR,Nelson LM.Premature ovaria failure .Endocrinol Metab Clin North Am,1998,27:989-1006.

5 Baggiolini M,Dewald B,Moser B.Human chemokines:an update.Annu Rev Immunol,1997,15:675-705.

6 Miller WL.Androgen biosynthesis from cholesterol to DHEA.Mol cell Endocrinol，2002,198:7-14．

7 Maclaran K,Panay N.Current concepts in premature ovarian insufficiency.Womens Health(Lond),2015,11:169-182.

8 Ferraretti AP,La Marca A,Fauser BC,et al.ESHRE Working Group on Poor Ovarian Response Definition.ESHRE consensus on the definition of ‘poor response’to ovarian stimulation for in vitro fertilization:the Bologna criteria.Hum Reprod,2011,26:1616-1624.

9 Ferraretti AP,Gianaroli L.The Bologna criteria for the definition of poor ovarian responders:is there a need for revision?Hum Reprod,2014,29:1842-1845.

10 Kovanci E,Schutt AK.Premature ovarian failure:clinical presentation and treatment.Obstet Gynecol Clin North Am,2015,42:153-161.