秀丽隐杆线虫物理损伤新方法的研究

朱怡 张云

（苏州大学 江苏 苏州 215000）

线虫为线虫动物门(Aschelminthes)线虫纲(Nematoda)所有蠕虫的通称，系动物界中数量最丰者之一，寄生于动、植物，或自由生活于土壤、淡水和海水环境中。这里所说的线虫特指秀丽隐杆线虫（C.elegans），是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫，以细菌为食。因其遗传背景清楚、个体结构简单、生活史短、基因组测序完成等，秀丽隐杆线虫作为模式生物在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛应用。

在大多数动物中，表皮是与外界环境接触、抵御外界病原体和损伤的第一道屏障。目前的研究表明，对秀丽隐杆线虫表皮进行物理损伤可以引起线虫固有免疫应答以及伤口愈合反应，因此研究秀丽隐杆线虫的物理损伤有重大意义。目前对线虫进行物理损伤的研究通常采用激光照射或显微针刺的方法，由于秀丽隐杆线虫成虫体长约1mm，肉眼难以辨别，对其进行激光照射或显微针刺难度较大，若需要批量损伤，操作费时费力，损伤程度无法均一，样本收集不方便，结果重复性较差，容易导致样本死亡，且伤口数量少，无法满足研究的需要。之前的研究证实，批量处理的线虫可用于新药筛选，将其分布于小分子化合物库中，利用染料染色等方法可筛选得到目的化合物，因此我们需要一种可以简便的对大批量线虫进行物理损伤的方法，以用于进行促进伤口愈合的新药筛选。

针对上述现有技术中的缺陷，我们要解决的技术问题是提供一种简便易行的线虫物理损伤新方法，利用玻璃碎片对线虫进行物理损伤，伤口多，存活率高，重复性好，可以满足批量损伤的需要。

为解决上述技术问题，我们所采取的技术方案是：

本实验提供一种利用玻璃碎片对线虫进行物理损伤的方法，具体步骤为：于NGM平板表面铺一层玻璃碎片，将带有线虫的NGM琼脂块带有所述线虫一面置于所述NGM平板的玻璃碎片上，适当按压所述NGM琼脂块让琼脂块紧贴平板，放置25～35分钟，然后将所述NGM琼脂块转移至一新NGM平板上，得到损伤效果均一的线虫样本。

其中，所述玻璃碎片由毛细玻璃管研磨得到，所述毛细玻璃管壁厚0.25mm。玻璃碎片依靠重力作用在水或乙醇中进行分离，使用75%乙醇溶液，达到去除过大或过小的碎片。由imageJ进行测量并分析每个玻璃碎片的最长轴线，由此得到的玻璃碎片的最长轴线为10～100um。将玻璃碎片用75%乙醇洗涤并储存在M9缓冲液中，保持玻璃碎片的清洁和完整。

具体操作步骤：

取一根0.25mm厚的毛细玻璃管，折断成小段放入研钵中进行研磨，直到玻璃碎片最长轴线为100um以下。将研磨得到的玻璃碎片放入75%乙醇溶液中，依靠不同大小的碎片在溶液中靠重力的沉降时间的差异，除去过大或过小的碎片，得到的玻璃碎片用imageJ进行测量并分析，测得玻璃碎片的最长轴线为10～100um（见图3）。得到的玻璃碎片（见图2）用于对线虫进行物理损伤。将得到的玻璃碎片用75%乙醇洗涤并储存在M9缓冲液中待用。

制作一个秀丽隐杆线虫生长的NGM平板，将上述玻璃碎片均匀平铺于NGM平板表面上，取一块带有数百条秀丽隐杆线虫的NGM琼脂块，倒置于放有玻璃碎片的平板上，使秀丽隐杆线虫与玻璃碎片充分接触，轻压琼脂块并放置25～35分钟，以使玻璃碎片的尖锐边缘对秀丽隐杆线虫造成物理损伤。然后将琼脂块转移至新NGM平板上，完成对秀丽隐杆线虫的物理损伤。压力不得过大，以免造成秀丽隐杆线虫损伤过大，同时也要保持琼脂块的完整，便于后期的转移。此过程示意图见图1。

本实验中对线虫样本进行物理损伤，造成的伤口较浅，存活率高（见图4）。用玻璃碎片对线虫进行物理损伤，线虫存活率为98%，针刺损伤存活率为53%（见图5)。同时本方法对线虫造成的伤口较多，对线虫进行玻璃损伤的伤口数量与针刺方法的伤口数量比为6∶1（见图6）。使用本方法对线虫损伤效果均一，重复性好，易得到损伤效果一致的样本。使用本方法物理损伤的线虫进行QPCR实验，结果重复性好，抗菌肽上调倍数在5.8至7.2之间（见图7）。另外，此方法便于收集样本，所得到损伤效果一致的线虫样本直接收集到琼脂块上，减少了转移环节，既节省程序，又减少了线虫在转移过程中的其它损伤和死亡。本方法中使用的材料简单，不需使用大型仪器设备，节约时间和使用成本，简便易行，适于批量损伤。使用本方法大批量对线虫进行物理损伤后收集的样本可进行促进伤口愈合的新药筛选。

图1

图2

图3

图4

图5

图6

图7