凋亡相关因子XAF—1和XIAP的表达及与膀胱癌复发的相关性研究

张庆德 蔡学辉 潘勇 姜文元 柳勇 吴永进 王健

[摘要] 目的 探討凋亡抑制蛋白XIAP和XIAP相关因子1（XAF-1）的表达及与膀胱癌复发的相关性。 方法 以第一次复发的20例膀胱癌患者（复发组）和其对应的20例初发的膀胱癌患者（初发组）为研究对象，对照组为20例复发的膀胱癌患者的正常膀胱组织。采用免疫组化方法（SABC）检测XIAP和XAF-1在初发组、复发组、对照组中的表达水平，分析与膀胱癌进展和复发的关系，同时分析XIAP和XAF-1与肿瘤数目、是否肌层浸润、临床分期及恶性程度分级的相关性。 结果 在初发组与复发组中XIAP的表达强度与临床分期、恶性程度分级呈正相关（P<0.05）；即XIAP在不同的临床分期、恶性程度分级的表达强度不同，分期越高，表达强度越强。在初发组与复发组中XAF-1的表达强度与临床分期、恶性程度分级呈负相关（P<0.05），即XAF-1在不同的临床分期、恶性程度分级的表达强度不同，分期越高，表达强度越低。XIAP、XAF-1的表达强度在肿瘤数目、是否肌层浸润均无明显相关性（P>0.05）。对照组、初发组、复发组XIAP指标与XAF-1指标相关（P<0.01），呈负相关，XIAP指标越高，XAF-1指标相对低。 结论 XIAP异常高表达和XAF-1异常低表达可能在膀胱癌发病和病情进展中起重要作用，为膀胱癌的治疗和判断预后提供了新思路。

[关键词] XIAP；XAF-1；膀胱癌；复发

[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）06-0024-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of apoptosis related factors XAF-1 and XIAP and their correlation with bladder cancer recurrence. Methods 20 patients with recurrent bladder cancer in the first time（recurrent group） and 20 patients with primary bladder cancer（primary group） were selected as the study subjects. The control group consisted of 20 normal bladder tissues of patients with recurrent bladder cancer. The expression levels of XIAP and XAF-1 in primary， recurrent and control groups were detected by immunohistochemistry（SABC）， and their relationship with bladder cancer progression and relapse was analyzed. At the same time， the correlation between XIAP， XAF-1 and the number of tumors， whether myometrial invasion， clinical stage and grade of malignancy was analyzed. Results The expression level of XIAP was positively correlated with clinical stage and malignant grade in the primary group and the recurrent group（P<0.05）， that was， the expression level of XIAP in different clinical stages and malignant grade was different， and the higher the staging， the stronger the expression intensity. The expression intensity of XAF-1 in primary group and recurrent group was negatively correlated with clinical stage and malignant grade（P<0.05）， that was， the expression level of XAF-1 in different clinical stages and malignant grade was different， and the higher the staging， the weaker the expression intensity. The expression intensity of XIAP and XAF-1 was not significantly correlated with the number of tumors and myometrial invasion（P>0.05）. The levels of XIAP in control group， primary group and recurrent group were negatively correlated with XAF-1（P<0.01）. The higher the XIAP， the lower the XAF-1. Conclusion Abnormal high expression of XIAP and abnormal low expression of XAF-1 may play an important role in the pathogenesis and progression of bladder cancer and provide a new idea for the treatment and prognosis of bladder cancer.

[Key words] XIAP； XAF-1； Bladder cancer； Recurrence

凋亡具有重要的生理和病理意义，凋亡异常则会导致机体发生肿瘤[1]。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）是一类在结构上具有同源性的细胞内源性凋亡抑制蛋白家族（IAP家族）。X染色体相关凋亡抑制蛋白（X chromosome-linked inhibitors of apotosis protein，XIAP）是IAP家族中调节作用最强，也是研究最广泛的凋亡抑制蛋白[2]。XIAP相关因子1（XIAP associate factor 1，XAF-1）是一个新近发现可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，研究提示XAF-1在介导肿瘤细胞凋亡受阻中具有重要作用，目前对于XIAP和XAF-1的表达及与膀胱癌复发性的研究鲜见报道，我们利用免疫组化方法（SABC法）检测50名初发膀胱癌患者和2年后第一次复发的20例膀胱癌患者（复发组），对照组为20例复发的膀胱癌患者的正常膀胱组织。以复发组和其对应的20例初发的膀胱癌患者（初发组）、对照组为研究对象，探讨其与膀胱癌复发的相关性。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

50例膀胱癌患者均为2012年2月～2014年10月经本院伦理委员会批准的泌尿外科住院和门诊随访的患者，纳入标准：（1）均为初发未治疗膀胱癌患者并经膀胱镜活检或者手术标本证实为移性细胞癌，其他类型的癌剔除；（2）所有患者均行TUR-BT，术中因特殊情况改其他手术方式的剔除；（3）术后均行早期灌注：术后4～8周，表柔比星（常用剂量为每次30～50 mg）每周1次膀胱灌注，之后维持灌注：每月1次，维持6～12个月。改变治疗方案者剔除；（4）均无手术禁忌证；（5）所选病例临床资料完整，2年内不复发的患者剔除；（6）标本：手术所取膀胱移行细胞癌标本，对照组取相应远离肿瘤（>5 cm）的正常组织标本，术中切除标本立刻放入4%甲醛溶液中保存。以第一次复发的20例膀胱癌患者（复发组）和其对应的20例初发的膀胱癌患者（初发组）为研究对象，对照组为20例复发的膀胱癌患者的正常膀胱组织。初发患者20例，男11例，女9例，年龄30～72岁，中位年龄56岁。病理分级：Low（G1）17例，High（G2-G3）3例。分期：T0-T1 16例，T2-T4 4例。非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）15例，肌层浸润性膀胱癌（MIBC）5例。肿瘤单发14例，肿瘤多发6例。复发患者20例，男11例，女9例，年龄32～74岁，中位年龄58岁。病理分级：Low（G1）13例，High（G2-G3）7例。分期：T0-T1 12例，T2-T4 8例。NMIBC 14例，MIBC 6例。肿瘤单发12例，肿瘤多发8例。

1.2 免疫组化染色法

XIAP山羊抗人多克隆抗体及免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），标本处理方法如下：新鲜标本经10%甲醛固定，浸蜡、包埋。常规HE染色，进行病理学分级和组织学分型。免疫组化法按试剂盒说明书进行。所有的病理学指标均由病理科资深医生确定。

1.3 结果判断

免疫组化染色结果判定：XIAP表达情况结果判断：镜检可见标本细胞胞浆中出现浅黄色至深棕色的颗粒，见图C、D、G、H、K、L。每张切片随机观察10个高倍镜视野（×400），对于胞质表达者，根据胞浆着色程度记分：0（无色，阴性），+（浅黄，弱阳性），++（棕黄，阳性），+++（棕褐，强阳性）；由固定的两名经验丰富病理科医师分别对免疫组化切片染色结果进行盲法阅片（未对此两名病理科医师告知患者术后诊断情况）。XAF-1表达情况结果判断：镜检可见标本胞核中出现浅黄色至深棕色的颗粒，见图A、B、E、F、I、J。结果判断比照XIAP结果判断方法：对于胞核表达者，着色程度评分方法为：对平均10个显微镜镜下（×400）随机视野进行评分：0（0%），+1（1%～25%），+2（26%～50%），+3（>50%），根据阳性着色细胞占阴性肿瘤细胞总数确定百分比。然后将10个视野的积分之和除以10，结果四舍五入取整数作为胞核染色强度的最后积分，积分为四个分段（0分，阴性；+1～2分，弱阳性；+3～4分，阳性；+5～6 分，强阳性）。

1.4 统计学分析

应用SPSS19.0统计软件整理数据库，计量资料正态分布采用均数±标准差表示，肿瘤数目计量资料偏态分布采用中位数和四分位数间距表示，计数资料采用[n（%）]表示，采用χ2检验，相关分析采用Spearman检验，P<0.05為差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

免疫组化实验结果显示各XIAP、XAF-1蛋白在膀胱癌细胞中表达程度及分布（封三图1～3），对照组（膀胱癌周围正常组织中的尿路上皮细胞）XIAP、XAF-1蛋白的表达程度及分布（封三图4）。实验显示：XIAP在膀胱癌中表现为明显胞质表达，XAF-1呈胞核表达。

2.2初发组、复发组与对照组XIAP、XAF-1指标表达强度与膀胱肿瘤参数及其他参数相关性

计数资料经χ2检验，是否基层浸润、恶性程度分级差异有统计学意义（P均<0.05），说明各组间存在差异。经Spearman相关分析，对照组、初发组、复发组XIAP指标与XAF-1指标相关系数R为-0.349，P=0.004<0.01，呈负相关，XIAP指标越高，XAF-1指标相对低；XAF-1指标同理。见表1。

Spearman相关性分析结果提示，初发组与复发组XIAP指标与临床分期相关系数为0.61（P<0.001），与恶性程度高低相关系数为0.55（P<0.001），呈正相关；XIAP指标越高，临床分期、恶性程度也越高。初发组与复发组XAF-1指标与临床分期相关系数为-0.34（P=0.03），与恶性程度高低相关系数为-0.37（P=0.02），呈负相关，XAF-1指标越高，临床分期、恶性程度也越低。见表2。

3讨论

现代研究证实，肿瘤与凋亡密切相关。XIAP是新近发现的IAP家族的新成员，在细胞凋亡调控中起着重要作用[3]。有研究提示XIAP可能在细胞的增殖过程和细胞向恶性转化过程中发挥重要作用[4]。XAF-1是XIAP负性调节因子之一[5]。研究表明XAF-1是一种具有潜能的肿瘤抑制因子[6]。本研究初发组与复发组中XIAP的表达强度与临床分期、恶性程度分级呈正相关（表2），提示XIAP与肿瘤的进展有关系密切，XIAP的异常高表达有利于细胞逃离生长监控，从而促进细胞的异常增殖和恶性转化，促进膀胱癌的发生和发展。研究发现XIAP抑制细胞凋亡的途径有多条，其一是通过Caspase途径抑制细胞凋亡，其二还通过NF-κB途径抑制细胞凋亡。XIAP还通过参与其他信号通路抑制细胞凋亡。国外还有研究证实XIAP还通过调节线粒体膜通透性来增强细胞凋亡抑制，这种机制已经被开发用于癌症治疗[7-9]。

Carsten Kempkensteffen等[10]认为XIAP在正常和恶性睾丸组织中普遍表达，在组织学亚组中XIAP mRNA水平没有明显差异。Shibata T等[11]认为XIAP表达水平在非肿瘤性胃黏膜和腺癌之间或在早期和晚期癌之间没有变化，以上均提示XIAP的表达组织特异性较强。而Kempkensteffen C等[12]认为睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）与正常睾丸组织相比，XAF-1和HtrA2表达水平随精原细胞瘤患者临床肿瘤分期的进展而逐渐升高，其表达水平相关性强，提示不同组织、不同肿瘤XAF-1的表达水平不同，与肿瘤进展的正负相关性不同。

本研究发现在初发组与复发组中XAF-1的表达强度与临床分期、恶性程度分级呈负相关（表2）。对照组、初发组、复发组XIAP与XAF-1呈负相关，XIAP指标越高，XAF-1指标相对低（表1）。现代肿瘤理论认为不改变基因序列，而通过自身化学修饰的方式从转录水平影响基因的表达、调控DNA功能，是肿瘤发生的重要机制，而甲基化研究是最深入的。肿瘤学研究还发现：（在人类基因组转录区，CpG相互聚集，称为CpG岛）基因启动子高度密集的CpG岛异常甲基化是导致肿瘤抑癌基因表达异常的内在机制。而XAF-1的表达与很多基因的CpG岛异常甲基化有关。Lee等[13]报道，XAF-1基因启动子区域-20至-695位点的CpG全部或部分位点的甲基化程度与XAF-1表达下降有关，并且与疾病进展相关，特别是膀胱癌的恶性程度。研究發现XAF-1基因通过在其启动子区CpG的甲基化使转录沉默，从而通过促进细胞凋亡损害细胞活力，有丝分裂灾变或细胞周期抑制，随着XAF-1转录抑制程度的加剧，使XAF-1蛋白表达减少，促凋亡能力不断下降，肿瘤细胞更易逃避凋亡而存活，进而促进膀胱癌病程的进展。因此，XAF-1启动子中的CpG甲基化代表涉及XAF-1沉默的主要表观遗传机制，并且因此对抗细胞凋亡有抑制作用。XAF-1的表达触发XIAP从胞质到细胞核的重新分布[14，15]。XIAP通过与半胱天冬酶结合并抑制其功能来抑制凋亡性细胞死亡。XAF-1拮抗XIAP活性，从而促进凋亡[16]。这表明缺乏XAF-1的表达导致凋亡异常可能是膀胱癌发生的重要机制，而且与膀胱癌的病情进展具有明显的相关性。与文献报道XAF-1的丢失与多种癌症中的恶性肿瘤进展有关[16]，与XAF-1水平在泌尿上皮癌细胞系中显著减少[13，16，17]一致，在胃癌中，XAF-1转录本水平的相对降低与肿瘤的阶段和等级相关，表明XAF-1的丢失有助于肿瘤的发生[8]。因此可以预见提高XAF-1水平的方法可以增加凋亡易感性并为癌症治疗提供另外的策略。XIAP的半胱天冬酶抑制活性受到至少XIAP相互作用蛋白XAF-1、Smac/DIABLO、Omi/HtrA2和热休克转录因子（HSF）1等的负调控[18，19]。除参与细胞凋亡调节外，XIAP也参与许多其他生物学重要的细胞活动，包括调节受体介导的信号转导和蛋白泛素化等。以上文献均提示XAF-1是凋亡促进过程的重要参与者之一。然而XIAP与XAF-1相互作用是十分复杂的，其间的生物学效应和分子事件仍然不能完全理解，更深入的、详细的分子学机制需要更多实验进一步阐明。

总之，本研究结果表明：XIAP异常高表达和XAF-1异常低表达可能在膀胱癌发病和病情进展中起重要作用，这为临床治疗和判断膀胱癌预后提供了新的思路，即抑制XIAP的表达和功能，同时恢复XAF-1的表达和功能，有可能成为膀胱癌治疗的一种新手段，监测XIAP和XAF-1对预测膀胱肿瘤的进展有帮助。

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（收稿日期：2017-11-23）