非小细胞肺癌中ZEB1和FoxO3a表达及意义

田亮　郭楠　苗志刚　郭效忠　张楠　彭宁宁　苗玉　张荣菊

摘 要：目的 研究E盒结合锌指蛋白1和叉头框家族蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达，并探讨其表达对非小细胞肺癌浸润、转移的影响。方法 收集2013年6月～2015年6月沧州市中心医院手术切除的130组非小细胞肺癌肿瘤组织和癌旁正常组织，免疫组织化学法和免疫印迹法检测E盒结合锌指蛋白1和叉头框家族蛋白蛋白的表达，分析E盒结合锌指蛋白1和叉头框家族蛋白与非小细胞肺癌临床资料的关系。结果 肿瘤组织E盒结合锌指蛋白1蛋白表达显著高于癌旁正常组织（P<0.05），而叉头框家族蛋白蛋白表达显著低于癌旁正常组织（P<0.05）；E盒结合锌指蛋白1和叉头框家族蛋白蛋白表达均与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、远端转移以及TNM分期显著相关（P<0.05）；在淋巴結转移或远端转移的非小细胞肺癌患者中，E盒结合锌指蛋白1蛋白表达显著升高（P<0.05），叉头框家族蛋白蛋白表达显著降低（P<0.05）；高表达E盒结合锌指蛋白1或者低表达叉头框家族蛋白的非小细胞肺癌患者术后2年生存率显著降低。结论 E盒结合锌指蛋白1在非小细胞肺癌组织中高表达，叉头框家族蛋白在非小细胞肺癌组织中低表达，两者协同促进非小细胞肺癌浸润转移。

关键词：FoxO3a；ZEB1；非小细胞肺癌；浸润；转移

中图分类号：R734.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.03.006

文章编号：1006-1959（2018）03-0016-05

Abstract：Objective To study the expression of zinc finger E binding protein 1 and forkhead box family proteins in non small cell lung cancer，and to investigate the expression of non small cell lung cancer， metastasis.Methods From June 2013 to June 2015，130 groups of non-small cell lung cancer（NSCLC）tumor tissues and adjacent normal tissues were collected from Cangzhou central hospital. Immunohistochemistry and western blotting were used to detect the expression of E-box binding zinc finger protein 1 and fork frame family protein.To analyze the relationship between E-box binding zinc finger protein 1 and fork box family protein and clinical data of non-small cell lung cancer.Results The expression of E-box binding zinc finger protein-1 protein in tumor tissues was significantly higher than that in adjacent normal tissues（P<0.05），while the protein expression of fork box family protein was significantly lower than that in adjacent normal tissues（P<0.05）.The expression of E-box binding zinc finger protein 1 and fork box family protein were significantly correlated with tumor size，differentiation，lymph node metastasis，distal metastasis and TNM stage（P<0.05）.In non-small cell lung cancer patients with lymph node metastasis or distant metastasis，the expression of E-box combined with zinc finger protein 1 （P<0.05）and protein of fork-framed family protein decreased significantly（P<0.05）.High expression patients with non-small-cell lung cancer with E-box combined with zinc finger protein 1 or with low expression of fork-frame family protein had a significantly lower 2-year postoperative survival rate.Conclusion The E-box combined with zinc finger protein 1 is highly expressed in non-small cell lung cancer tissues，and the forkhead box family protein is low expressed in non-small cell lung cancer tissues.Both of them can promote the invasion and metastasis of non-small cell lung cancer.

Key words：FoxO3a；ZEB1；Non-small cell lung cancer；Invasion；Metastasis

肺癌是我国最常见的肿瘤和致死病因，超过80%的肺癌患者为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC），按组织学分类，主要包括腺癌，鳞状细胞癌和大细胞肺癌[1]。研究表明，超过90%NSCLC患者死于转移，但目前NSCLC细胞转移启动的分子机制尚不明确[2]。有研究指出[3]，由连接紧密、具有细胞极性的上皮细胞逐步转化为组织松散、缺乏细胞连接和细胞极性的间质细胞过程——上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），使癌細胞获得侵袭迁移能力，是转移的先决条件。因此研究EMT相关蛋白在NSCLC组织中的表达，将有助于揭示NSCLC细胞转移启动的分子机制。目前研究证实，E盒结合锌指蛋白1（ZEB1）和叉头框家族蛋白（FoxO3a）蛋白异常表达均与肿瘤的浸润迁移有关[4，5]，但关于ZEB1和FOXO3a在NSCLC组织表达相关性研究还较少，本文通过免疫组织化学及免疫印迹方法检测ZEB1和FoxO3a蛋白在NSCLC组织中的表达，分析其表达与临床病理资料的关系，探讨NSCLC组织中ZEB1和FoxO3a表达的相关性及其对NSCLC浸润转移及预后的影响，为揭示NSCLC细胞转移启动分子机制提供理论依据，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料 收集2013年6月～2015年6月沧州市中心医院标本130例，术前所有患者均未进行化疗或放疗。所有程序经过医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意。非上皮源性肿瘤，转移性肿瘤，大细胞癌和小细胞癌不在研究之列。所有病例均经三位高年资医师按WHO肺癌分型标准进行复诊[6]。其中鳞状细胞癌38例，腺癌92例，男性79例，女性51例，淋巴结转移80例，未转移50例，肿瘤分期参照第8版国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）[7]，I/II期88例，III期42例。每例患者包括肿瘤组织和癌旁正常组织（距离>5cm），其中每例均预留新鲜组织冻存于液氮中。

1.2主要试剂与仪器 FoxO3a兔多克隆抗体、ZEB1兔多克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体（Abcam）；10XPBS（Hyclone，美国）；组织总蛋白提取试剂盒，双色红外激光成像系统（LICOR， 美国）。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学方法检测ZEB1和FoxO3a蛋白表达 标本经常规10%福尔马林固定液固定，石蜡包埋，HE染色，挑选合适蜡块，4 μm厚度白片，免疫组化采用SP法，PBS代替一抗作为阴性对照。Fox3a定位于细胞核，ZEB1定位于细胞核和细胞浆，免疫组化判定参照Yueming Zhang[8]等人标准：按阳性细胞率判断，<25%=0分，25%-75%=1分，>75%=2分；按染色强度判断，缺失（无色）=0分，弱（淡黄色）=1分，中度（棕黄色）=2分，强（棕褐色）=3分；以阳性细胞率评分和染色强度评分之积A≥4判定为高表达，<3判定为低表达。

1.3.2免疫印迹法检测ZEB1和FoxO3a蛋白 将冻存于液氮的组织标本取出，参照购买的组织总蛋白提取试剂盒说明书提取组织总蛋白，测定总蛋白浓度后，依次经SDS-PAGE5%脱脂牛奶封闭、FoxO3a或ZEB1或GAPDH一抗孵育、羊抗兔二抗孵育等实验步骤后显色，以目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值表征目的蛋白的相对表达量。

1.4统计学分析 通过SPSS20.0软件包对研究数据进行统计学分析，计数资料（%）表示，组间比较χ2检验，计量资料以（x±s）表示，组间比较t检验，Pearson法分析两指标间的相关性，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫组化检测ZEB1和FoxO3a蛋白表达 130例NSCLC肿瘤组织和癌旁正常组织进行免疫组化染色并进行评分，结果显示：①ZEB1蛋白在肿瘤组织中高表达83例、低表达47例，免疫组化评分（4.02±1.56）分；ZEB1蛋白在癌旁正常组织全部呈低表达，免疫组化评分（0.94±0.78）分；②FoxO3a蛋白在肿瘤组织中高表达55例、低表达75例，免疫组化评分（2.69±1.79）分；FoxO3a蛋白在癌旁正常组织全部呈高表达，免疫组化评分为（4.97±1.00）分。

2.2 ZEB1和FoxO3a蛋白表达与NSCLC患者临床资料的关系 130例NSCLC患者中ZEB1蛋白高表达83例，低表达47例，分析ZEB1和FoxO3a蛋白表达与NSCLC临床资料间的关系发现：ZEB1和FoxO3a蛋白表达均与NSCLC患者性别、年龄和临床分型无关（P>0.05），而均与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移以及TNM分期显著相关（P<0.05），见表1。

2.3 ZEB1和FoxO3a蛋白表达与NSCLC转移的关系 130例NSCLC患者中，80例发生淋巴结转移，50例未发生淋巴结转移，免疫组化结果显示：ZEB1蛋白在淋巴结转移NSCLC患者肿瘤组织评分为（4.39±1.35）分，显著高于淋巴结未转移（3.42±1.70）分评分（P<0.05）；FoxO3a蛋白蛋白在淋巴结转移NSCLC患者肿瘤组织评分为（2.44±1.57）分，显著低于淋巴结未转移评分（3.10±2.04）分（P<0.05）。免疫印迹检测结果显示：ZEB1蛋白在淋巴结转移NSCLC患者肿瘤组织相对表达量为（1.47±0.32），显著高于淋巴结未转移（0.62±0.13）（P<0.05）；FoxO3a蛋白在淋巴结转移NSCLC患者肿瘤组织相对表达量为（0.10±0.02），显著低于淋巴结未转移（0.81±0.14）（P<0.05），见图1。

2.4 ZEB1和FoxO3a表达与NSCLC临床预后的关系 130例NSCLC患者术后进行为期2年的随访，结果显示：ZEB1高表达NSCLC患者术后2年生存率为48.19%，低于低表达患者65.96%术后2年生存率（P<0.05），见图2；FoxO3a低表达NSCLC患者术后2年生存率为52.00%，低于低表达患者60.00%术后2年生存率（P<0.05），见图3。

2.5 NSCLC组织ZEB1和FoxO3a蛋白表达的相关性 通过免疫组化法和免疫印迹法分别检测130例NSCLC肿瘤组织ZEB1和FoxO3a蛋白表达情况：同一NSCLC患者肿瘤组织ZEB1蛋白表达越高，则FoxO3a蛋白表达越低。

3讨论

肿瘤的发生发展是一个多因素调控、十分复杂的生物学过程，其中，EMT过程是肿瘤细胞获得侵袭迁移能力的关键环节，获得EMT特征的肿瘤细胞与化学药物抵抗有关，是标准化疗治疗后复发和转移的一个因素。绝大多数NSCLC肺癌患者确诊时很晚，往往已出现侵袭和转移，大约2/3的患者失去根治性手术的机会，预后差。因此，研究NSCLC细胞侵袭/迁移分子机制，不仅为NSCLC靶向性药物的开发提供理论依据，而且将有助于准确判断患者预后。

ZEB1又称为TCF8或δEF1， 位于人类10号染色体短臂上，是一种胚胎早期发育所必须的转录因子。ZEB1可抑制上皮型标志物E-cadherin等的表达，是EMT过程中关键性诱导基因，促进肿瘤细胞向具有高侵袭和迁移能力的间质表型转变[4]。近期多项研究指出，ZEB1蛋白在乳腺癌[5]、甲状腺癌[10]、卵巢癌[11]以及肺癌[12]中均呈现高表达，并且癌细胞中高表达ZEB1可驱动EMT，进而赋予或增强癌细胞侵袭/迁移能力。仲楼等人[14]采用RT-PCR和Western Blotting方法检测肺鳞状细胞癌组织和肿瘤细胞株中ZEB1mRNA和蛋白的表达情况，ZEB1在肺鳞状细胞癌组织中高表达，其表达变化与肺鳞状细胞癌的病理特征密切相关；提示ZEB1在肺癌的发生发展中起重要作用。本研究结果相似，ZEB1蛋白在NSCLC组织中呈高表达，进一步分析ZEB1蛋白表达与NSCLC患者临床资料关系发现，ZEB1蛋白与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、远端转移以及TNM分期显著相关，并且在出现转移的NSCLC患者中表达更高。E-cadherin蛋白具有细胞间以及细胞与基底膜相互吸附的作用，作为EMT过程中的上皮标志物，E-cadherin蛋白具有抑制肿瘤细胞迁移的作用，当E-cadherin蛋白表达减少，则预示着肿瘤细胞的迁移以及侵袭能力得到增强[13]。国内外多项研究证实[4，14]，ZEB1蛋白不仅可以通过与转录因子Slug结合，而且还可以被癌基因或者micro-RNA等上调表达而抑制E-cadherin蛋白的表达进而诱导肿瘤细胞EMT。

当前， FoxO3a之一是最近深入研究的关键蛋白，是一个抑癌基因，也是调节许多细胞功能不可缺少的转录因子，研究证实在多种肿瘤组织中呈现缺失表达。近几年，FoxO3a与肿瘤EMT相关研究逐渐被人们重视，发现其通过对相关通路的抑制而对EMT过程进行调节。Ni D等[15]在透明细胞癌细胞株中研究发现，缺失表达FoxO3a可以通过上调SNAIL1蛋白表达而诱导肾癌细胞EMT，进而在体内外促进肾癌细胞的转移；Belguise K等[16]在乳腺癌中的研究指出，FoxO3a可以通过激活ERα信号抑制乳腺癌细胞浸润。而在肺癌中，Cheng CW等人[17]发现，FoxO3a可以通过抑制HIF-1α激活的EMT而阻碍肿瘤转移。所以FoxO3a在NSCLC中低表达的可能是NSCLC浸润迁移的促进因素。本研究发现，FoxO3a蛋白在NSCLC组织中呈现低表达，并且其表达与NSCLC肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、远处转移以及TNM分期显著相关。

ZEB1蛋白高表达和FoxO3a蛋白低表达均通过增强NSCLC细胞的侵袭迁移能力而促进NSCLC疾病进展，本研究发现NSCLC患者肿瘤组织ZEB1蛋白表达越高，则FoxO3a蛋白表达越低。虽然，目前关于FoxO3a与ZEB1在肿瘤组织中的相互作用机制还未被揭示，但是相关研究证实，PI3K/AKT不仅可以通过与SHP-2蛋白结合以驱动胶质瘤PDGFRα介导的ZEB1-miR-200反馈环[18]，还可以通过靶向调控GSK3β/β-catenin信号通路的传导，以控制ZEB1基因转录，进而调控细胞角蛋白、波形蛋白和MMP2的表达[19]。同时，miR-200c通过PI3K/Akt信号通路和靶向ZEB1增强NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性，并诱导NSCLC细胞凋亡[20]。而FoxO3a作为PI3K/AKT信号通路下游关键效应蛋白也可能参与肿瘤细胞ZEB1基因表达调控。

綜上所述，在非小细胞肺癌组织中FoxO3a低表达和ZEB1高表达可能通过PI3K/AKT信号通路的介导协同增强NSCLC细胞侵袭/迁移能力而促进NSCLC浸润/迁移。

参考文献：

[1]Chen W，Zheng R，Baade P D，et al.Cancer statistics in China，2015[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians，2016，66（2）：115-132.

[2]王春梅，高艳丽，尹丽霞.非小细胞肺癌放射治疗研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2017，24（10）：720-724.

[3]Seton-Rogers S.Epithelial-mesenchymal transition：Untangling EMT's functions[J].Nature Reviews Cancer，2016，16（1）：1.

[4]Yu J M，Sun W，Hua F，et al.BCL6 induces EMT by promoting the ZEB1-mediated transcription repression of E-cadherin in breast cancer cells[J].Cancer Letters，2015，365（2）：190-200.

[5]Liu H，Yin J，Wang H，et al.FOXO3a modulates WNT β-catenin signaling and suppresses epithelial-to-mesenchymal transition in prostate cancer cells[J].Cellular Signalling，2015，27（3）：510.

[6]Travis WD，Brambilla E，Mqller-Hermelink HK，et al.World Health Organization classification of tumours.Pathologyand genetics of tumours of the lung，pleura，thymus and heart[M].4th，Lyon：IARC Press；2015.

[7]Rami-Porta R，Bolejack V，Crowley J，et al.The IASLC Lung Cancer Staging Project Proposals for the Revisions of the T Descriptors in the Forthcoming Eighth Edition of the TNM Classification for Lung Cancer[J]. J Thorac Oncol，2015，10（7）：990-1003.

[8]Y Zhang，L You，J chen，et al.Expression of kinesin family member 3B is associated with poor prognosis in epithelial ovarian cancer patients[J].Int J Clin Exp Pathol，2017，10（3）：2834-2842.

[9]Guan H，Liang W，Xie Z，et al.Down-regulation of miR-144 promotes thyroid cancer cell invasion by targeting ZEB1 and ZEB2[J].Endocrine，2015，48（2）：566-574.

[10]Niu K，Shen W，Zhang Y，et al.MiR-205 promotes motility of ovarian cancer cells via targeting ZEB1[J].Gene，2015，574（2）：330-336.

[11]Larsen J E，Nathan V，Osborne J K，et al.ZEB1 drives epithelial-to-mesenchymal transition in lung cancer[J].Journal of Clinical Investigation，2016，126（9）：3219.

[12]仲楼，史加海，曹飞，等.ZEB1的表达与肺鳞状细胞癌侵袭及转移的关系[J].吉林大学学报（医学版），2012，38（4）：761-765.

[13]Coopman P，Djiane A.Adherens Junction and E-Cadherin complex regulation by epithelial polarity[J].Journal of Marine Systems，2016，73（18）：3535-3553.

[14]Cappellesso R，Marioni G，Crescenzi M，et al.The prognostic role of the Epithelial-Mesenchymal Transition markers E-cadherin and Slug in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Histopathology，2015，67（4）：491-500.

[15]Ni D，Ma X，Li H Z，et al.Downregulation of FOXO3a promotes tumor metastasis and is associated with metastasis-free survival of patients with clear cell renal cell carcinoma[J].Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research，2014，20（7）：1779-1790.

[16]Belguise K，Guo S，Sonenshein G E.Activation of FOXO3a by the Green Tea Polyphenol Epigallocatechin-3-Gallate Induces Estrogen Receptor Expression Reversing Invasive Phenotype of Breast Cancer Cells[J].Cancer Research，2007，67（12）：5763.

[17]Cheng CW，Chen PM，Hsieh YH，et al.Foxo3a-mediated overexpression of microRNA-622 suppresses tumor metastasis by repressing hypoxia-inducible factor-1α in ERK-responsive lung cancer[J].Oncotarget，2015，6（42）：44222.

[18]Zhang L，Zhang W，Li Y，et al.SHP-2-upregulated ZEB1 is important for PDGFRα-driven glioma epithelial-mesenchymal transition and invasion in mice and humans[J].Oncogene，2016， 35（43）：5641-5652.

[19]Wu K，Fan J，Zhang L，et al.PI3K Akt to GSK3β β-catenin signaling cascade coordinates cell colonization for bladder cancer bone metastasis through regulating ZEB1 transcription[J].Cellular Signalling，2012，24（12）：2273-2282.

[20]Zhou G，Zhang F，Guo Y，et al.miR-200c enhances sensitivity of drug-resistant non-small cell lung cancer to gefitinib by suppression of PI3K Akt signaling pathway and inhibites cell migration via targeting ZEB1[J].Biomedicine&Pharmacotherapy;，2017，85（11）：113-119.

收稿日期：2017-11-10；修回日期：2017-11-13

編辑/李桦