国标法检测蜂蜜淀粉酶值实验教学改革与创新

杨萍萍，袁 朋，徐瑞雪，李建亮，崔言顺

(山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271000)

蜂蜜的营养价值很高，口感独特，深受消费者欢迎[1-2]。在蜂蜜所含有的一系列营养物质中，生物酶是其主要的生物活性物质，其中淀粉酶的含量最高，能够促进人体对食物的消化和营养物质的吸收[3-4]。但目前市场上蜂蜜产品的质量参差不齐，真假难辨[5-8]，而蜂蜜淀粉酶活性的检测是控制商品化蜂蜜产品质量和安全的重要指标之一[9-10]。

蜂蜜淀粉酶值的检测方法有试管比色法和分光光度计法，其中分光光度计法是最新的国家标准方法[11-12]。为和社会实际衔接，学校对蜂蜜淀粉酶值检测的实验教学进行了一系列的改革，其中“国标进课堂”取代陈旧实验方法就是其中一项重要举措。在改革的过程中发现实验教学不同于简单的实验验证，需要几十人同时进行，涉及仪器、耗材、场地的共享使用，简单地照搬照抄国标方法并不能直接用于实验教学。为使国标法更好地适应实验教学，山东农业大学卫生检验教研组对蜂蜜淀粉酶值检测的部分内容进行了改革和创新。

1 实验方案的设计

1.1 材料

1)蜂蜜：来源于山东泰安某养蜂场的新鲜百花蜜。

2)试剂及配制：碘化钾、碘、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)、可溶性淀粉、氯化钠、冰乙酸等均为国产分析纯。按国标GB/T18932.16—2003要求[12]分别配制0.5 mol·L-1氯化钠溶液、乙酸盐缓冲液、2%淀粉溶液、碘溶液等。

3)仪器：超纯水系统(Pall，USA)；微量移液器(Eppendorf，Germany)；电子恒温水浴锅(常州国立，中国)；Elx808多功能全自动酶标仪(Biotek，USA)；可拆分酶标板(江苏光明器材)。

1.2 方法

1)样品准备。将采购的蜂蜜样品充分搅拌均匀，勿加热。每组分装100 g于烧杯中作为待检样品，标记后供淀粉酶值测定用，常温保存，勿冷藏。

2)标定淀粉溶液。3支试管分别装有10 mL水、5 mL淀粉溶液和10 mL碘溶液，放入40℃水浴中预热15 min。然后将5 mL淀粉溶液全部加入到10 mL水的试管中混合均匀作为待检的样品混合液，从中吸取1 mL混合液加入到10 mL的碘溶液试管中，再加入一定体积的水稀释(先加入少量，需多次加入确定准确的水体积)。取200 mL加入酶标板的检测孔中，以水作为空白参照，用多功能全自动酶标仪在660 nm波长测定溶液的吸光度(原国标中是用分光光度计进行检测，需取2 mL加入比色皿中待检)，若吸光度值较高则继续加水进行检测，直到产生0.760±0.02的吸光度值。记录多次加入的全部水的体积数，并以此作为检测样品溶液时的稀释系数。淀粉溶液新配制后应重新进行标定。

3)样品检测。

①全自动酶标仪的检测条件，波长为660 nm；阴性对照为水。

②样品处理，称取精确至0.01 g的蜂蜜样品5 g，加入水15 mL和乙酸盐缓冲液2.5 mL，玻璃棒搅拌混匀后全部转移到提前加入氯化钠溶液1.5 mL的25 mL容量瓶中，加水定容，作为样品溶液待检。

③样品检测，5 mL淀粉溶液1支、10 mL样品溶液1支和10 mL碘溶液15支(原国标方法中碘溶液是1支)，均提前放入40℃水浴中预热15 min。将5 mL淀粉溶液全部转入样品溶液，然后充分混合开始计时。5 min时取样品混合溶液1 mL加入到盛有10 mL碘溶液的试管中，以标定淀粉溶液时确定的水的体积数稀释并混匀充分。取200 mL加入酶标板的检测孔中，以水作为空白参照，用多功能全自动酶标仪于660 nm波长处测定待检样品吸光度(原国标方法中使用分光光度计进行检测，需取2 mL待检液加入比色皿中，且比色皿要不断清洗，并漂洗)。如吸光度值大于特定吸光度值0.235，则重新吸取样品混合液加入到另1支碘溶液中进行测定，每隔5 min检测一次，直到吸光度值小于0.235为止。

④ 数据处理，以吸光度值为纵坐标，检测时间为横坐标，在对数坐标纸上作图，连接各点成直线。然后在直线上查出样品吸光度与0.235交叉点所对应的检测时间，计算结果为:

X=300/t

式中，X为所测样品溶液的淀粉酶值，单位为mL·g-1·h-1(毫升每克小时)；t为对应的检测时间，单位为min。

2 实验教学的实施

2.1 学生分组

在实验开始前，指导教师提前一周进行实验布置，学生自由组合成2～3人的小组，小组内成员合理分工，并指定一人负责实验用品的领用、归还以及数据的统计、报送等。由班长负责统计分组数及小组成员名单，并于实验开始前上报给指导教师，由实验教师审核成员组合及分工是否合理。实验样品、耗材、器皿等均按小组编号分发。

2.2 实验准备

指导教师提前布置实验内容，制定实验目标和要求。实验教师进行实验器材分组，并准备好备份。然后学生以实验小组为单位，课前进行合理分工，查阅相关资料，熟悉实验器材，制定出具体的实验方案。指导教师针对每个小组的实验方案提出指导性意见和建议。

2.3 实验过程的改进

国标方法“蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法GB/T18932.16—2003”在用于本科实验教学时，由于参与实验人数多、实验场地拥挤、仪器数量有限等原因，在实验教学过程中出现了诸多问题，不能有效保障实验秩序的稳定和实验结果的有效性。为有利于实验教学的顺利进行，学校卫生检验教研组对实验方法及仪器检测等进行了部分改进。

首先为减少误差，使实验中所用试剂准确保持在40℃，样品检测中除了提前将样品、淀粉溶液和碘溶液放在水浴中保温外，需准备15支10 mL的碘溶液而不是1支。原因是淀粉和样品混合液共有15 mL，每次取1 mL可以取15次，而碘溶液10 mL只能使用一次，即使大瓶的碘溶液放在水浴中能保持在40℃，但分装用的试管没有预热仍会造成误差，从而影响实验结果。预热15支碘溶液比原国标方法中仅预热1支碘溶液能更有效地保证实验结果的精确度、科学性和有效性。

其次检测仪器使用多功能酶标仪替代分光光度计。在样品检测过程中需要5 min测定一次，若OD值变化较快，则需要1 min测定一次，时间间隔比较短，不同小组之间不可能共用1台分光光度计。以一个班10～15个小组计至少需要10～15台分光光度计，而目前实验室的条件最多只能提供4台，远远不能满足需要。再加上更换、清洗比色皿以及校零的时间，误差在所难免。而多功能酶标仪配合使用可拆分一次性酶标条，一个小组1条8个孔，自己做好标记，每次加样1孔，一台酶标仪可同时检测12个小组，且不用清洗，自动校零，大大提高了时间的精确性和结果的准确性。

2.4 实验考核

实验课程的考核以小组为单位进行，兼顾小组中个人的表现。分别从文献查阅是否充分、实验方案设计是否合理、实验操作是否规范、实验结果判断是否合理，以及实验卫生整洁程度等方面做出评价。

3 实验教学效果

3.1 实验秩序

该次实验教学经过对参与实验的学生提前分组，以小组为单位进行实验方案的设计和准备，然后独立完成实验操作以及数据的记录和整理计算，发现除个别小组准备不充分，仪器操作不够熟练外，其余组都进行了充分的资料收集和器材准备，实验进行得有条不紊，井然有序。完全不同于之前实验课中无准备、无目的性地照着板书上实验步骤呆板地称量加样、少数学生动手多数学生在实验室中转圈、依赖老师操作仪器等状况。准备不充分的小组在看到别的小组实验进展顺利时明显感受到了压力，这将对以后的实验准备工作起到一定的督促作用。

3.2 改进效果

从蜂场采集的新鲜蜂蜜淀粉酶值一般在8～10之间，测定过程至少需要持续30～45 min，5 min测定一次则需要测定10～15次，国标中样品混合液可以待检15次，而碘溶液只有1支，测定过程中需要不断重装碘溶液，碘溶液的温度得不到保证，且学生需要不断在实验室中来回走动，造成秩序混乱。温度是影响酶促反应的决定性因素，反应温度的差异将会直接导致酶促反应的快慢不一致，致使最终计算出的淀粉酶值出现误差。改进后的国标法直接准备好15支碘溶液，需要测定时随取随用，既避免了实验过程中学生频繁找试管、洗试管、重装碘溶液的麻烦，保证了实验温度的一致性和实验结果的精确度，又使实验进行得井然有序，保障了实验秩序。

分光光度计一般只有4个比色皿槽，其中1个要加入空白对照，仅余下3个槽位可以放置待检样品，放置好后需要手动拉杆检测，检测样品少，且需要时间比较长。另外比色皿需要及时清洗、再用待检液漂洗，在本实验中样品需要5 min检测一次，就会显得手忙脚乱，导致实验结果出现不可避免的误差。而全自动酶标仪具有连续波长，波长选择范围比较大，能够满足不同波长的需求。实验中使用可拆分96孔酶标板，可同时检测96个样品，即使一个小组1条，也可以同时检测12个小组的样品。且全自动酶标仪可以自动进样，然后进行扫描检测，只要提前在电脑上设计好板的布局，将酶标板放在检测台上，点击“检测”就可以了，检出结果会自动扣除空白或者阴性对照，一目了然。既避免了实验过程中清洗比色皿更换样品的环节，又缩短了学生等待检测的时间，减少了实验误差，有效保障了实验数据和结果的准确性。

3.3 考核结果

鉴于本科实验教学中学生的独立性稍差，无法单独完成整个实验设计及具体操作，因此采用小组内团队合作的形式进行实验。在考核时要兼顾到小组的整体成果和小组内个人的贡献和表现。在对每个小组的实验过程进行考核时发现大部分小组对数据的记录、整理、计算等非常清晰，课后能够对实验过程和实验结果进行完整的总结汇报和正确的结果分析，甚至有的小组还配备了图片说明实验过程中随时间变化淀粉酶分解淀粉后剩余淀粉和碘溶液反应产生颜色的变化过程。表明学生在实验过程中对出现的结果及数据变化进行了充分的思考和分析，这次实验教学的改进充分调动了学生的实践动手热情，也促进了高校对创新型人才的培养。

4 结束语

“民以食为天，食以安为先”，国标进课堂进行蜂蜜的卫生检验，缩短了高校与社会之间的距离，激发了学生的学习热情。而改进后的国标法应用于实验教学保障了实验结果的准确性，减少了误差。同时高值精密仪器的使用也拓宽了学生的视野[13]，调动了学习的积极性，提高了实践动手能力，收到了超出预期的实验教学效果。