如何提高病毒外源因子检测中小鼠和乳鼠检查法的成功率

冯学轩 钟志勇 严家荣 黎莉斯 邝少松

(广东省医学实验动物中心，广州 528248)

随着医药研究的发展，生物制品在临床上的使用率日趋上升，且应用范围日益广泛，在使用频率和使用人群不断上升的情况下，安全性问题随之而来。生物制品大多使用动物血清、细胞基质、蛋白酶等进行选育、培养，且生产过程中人工操作等影响因素较多，因此十分容易受到外源的病毒、微生物，包括细菌、真菌、支原体、螺原体、分枝杆菌、立克次氏体、原生动物、寄生虫、朊粒及病毒(包括细胞系/株本身携带的逆转录病毒和外界污染的病毒)等的污染[1-2]，且一旦受污染的制品流于临床，容易导致使用者出现生命危险，或引发流行性疾病，后果不堪设想。因此，对于生物制品，如病毒类制品，细胞制品等的安全性均要进行严格的把控。

目前，无论是WHO、欧盟、美国 FDA，还是我国药典，均对疫苗外源病毒污染检测和控制有严格要求[3]。2015年版中国药典三部通则里，也参照欧洲药典对外源因子的检测作了规定[1]。但规定中的一些细节问题及操作方法也未作明确描述，加上病毒类外源因子感染细胞后短期内无明显特征，因此肉眼难以分辨，若在外源因子的检测过程中操作不当，或者供试品给予剂量不准确等，则将容易导致假阴性或假阳性的结果[4]。

在外源因子的检测方法中，对于小鼠法和乳鼠法，笔者通过多次的验证、探讨，对于如何提高实验的准确性及成功率，具有一定的心得，特作以下的经验总结。

1 供试品的前处理

取样时应遵循随机、足量及最大限度暴露毒性的原则。具体可参照2015版中国药典三部通则3302关于供试品制备原则的相关要求。若受试样品为细胞或细胞上清液，细胞应尽量在原单位生产后尽快接种，细胞上清液则采用原液接种，无特殊情况，尽量不作稀释[5]。

2 小鼠法和乳鼠法中脑内接种的方法

小鼠法和乳鼠法均需要脑内接种与腹腔接种，其中脑内接种方法难度稍大，接种时是否漏液，会否影响动物的存活率等因素对实验结果的判断有着至关重要的影响。

2.1 小鼠脑内接种操作方法的选择

小鼠脑内接种时，常用两种方法，一种方法是从眼窝后方，眼角处往斜上方进针，有落空感后停止进针，注射药液；另一种方法是从两眼连线的正中间垂直进针，刺破头骨后停止进针，注射药液。有文献报道第一种方法对小鼠影响较小，但个人实践后发现，第一种方法由于各鼠间的进针深度受每次操作时进针的角度、力度等影响，即便同一人操作，也难以做到操作上的一致性，由此导致各鼠间在给药过程中就存在着较大差异。笔者曾尝试在针柄处套上橡胶套以固定进针深度，但每只动物体型上的差异会导致其进针深度存在一定的个体差异，因此最适宜的进针深度并非完全一致。此外，此法的进针深度较大，且进针后，由于针头与颅顶呈一定角度，一旦控制不好，十分容易损伤脑组织，影响动物健康。因此，笔者建议采用第二种注射方法：从两眼连线的正中间垂直进针。此法进针较浅，且垂直进针，操作简单，只要针尖斜面没过头骨即可注射，加之同一体质量段的各鼠颅骨厚度差别较小，因此进针深度较为一致，可采用针柄处套橡胶套的方法固定进针深度，这样各鼠间的偏差较小，且对小鼠颅脑组织影响较小，安全易行。

2.2 小鼠脑内接种操作要点

注射时使用50 μL或100 μL的微量注射器，操作时需注意：首先，须在针柄上套一橡胶管套以控制每次的进针深度，避免力度控制不稳，进针过深，损伤脑组织，深度一般以没过针尖斜面1～2 mm即可。其次，捉取动物时，左手拇指与食指从两耳稍往前捉紧动物头部皮肤以固定头部，避免动物头部动弹而影响注射。此外，注射完毕后，快速直接拔针，不旋转针头，以免损伤脑组织。拔针后左手两手指迅速往前推动，捏紧注射部位的针口数秒，以防漏液。最后，注射时，应匀速，且速度切勿过快，以免动物因颅内压急剧升高而至死亡，且应一次注射完毕，避免二次注射。

2.3 乳鼠脑内接种操作要点

乳鼠脑内接种时，针柄同样需套一橡胶管套以固定进针深度，但橡胶管只需固定至针尖斜面上约0.05 mm，不超过1 mm。捉取乳鼠时，将乳鼠侧卧，自眼睛与耳朵连线中点发白处进针，进针深度以没过针尖斜面约0.05 mm即可，过浅则漏液，过深乳鼠则容易死亡。注射时也应缓慢匀速，避免颅内压急剧升高。注射完毕后同样直接拔针，并迅速以棉花压迫注射部位，以免漏液[6]。需注意的是，由于乳鼠较小，且易动，注射时注意固定动物及避免针头动弹，必要时可一人捉取动物及固定微量注射器，另一人负责缓慢推针。

3 乳鼠试验法中如何避免母鼠吃仔

由于2015版中国药典规定乳鼠试验法中需采用出生24 h内的乳鼠，大多数情况下，由于母鼠刚生产，对人员及外界环境较为敏感，一旦受惊吓，则容易引起母鼠吃仔的情况发生，且人员操作完毕后，乳鼠身上若残留有人员的气味，更容易出现母鼠吃仔的问题。因此，如何防止母鼠吃仔，成为了乳鼠试验法是否成功的关键。

实验时，若需将窝鼠移动至实验场所，则移动时动作应轻柔，避免移动过程颠簸，移至实验场所时，窝鼠应至少适应30 min后再行实验。试验前将少量灭菌后无味的棉花放至窝鼠中，以沾染母鼠气味，约15 min后，将母鼠与乳鼠分笼。操作时实验人员应更换新手套，并用医用酒精喷手。注射完后乳鼠可放置于鼠笼的另一角，并用事先放置的棉花与未注射的乳鼠分隔，避免混淆。全部乳鼠注射完毕后，取走棉花，取笼中垫料洒于乳鼠身上，单独饲养至少30 min后，再将母鼠与乳鼠合笼，合笼前用酒精棉球在母鼠鼻子上擦拭，以降低母鼠嗅觉的灵敏度，合笼后需观察一段时间，若出现母鼠吃仔的情况，则应立刻将母鼠与仔鼠分笼，较长时间后再按前述方法合笼。在注射不同窝的窝鼠时，也应更换新手套并用医用酒精喷手。

以上为笔者在实验过程中的经验总结，仅供参考，望能提高外源病毒因子检测的操作可行性与结果准确性。