白血病动物模型的研究进展

任汝静 尹 婷 洪 坤 孙建辉 王丽芳 代宝强 朱亚英 谭余庆

（中国中医科学院中药研究所，北京 100700）

白血病是一类严重的血液系统疾病，是由造血干细胞的恶性克隆引起的[1-2]。由于白血病细胞的无限增殖、分化障碍和凋亡受阻等原因，使得白血病细胞在造血系统尤其是骨髓中大量的聚集，并向其他组织和器官转移，造成对全身器官和组织的感染与浸润，严重影响正常造血功能。近年来，由于白血病的高发与难治愈等因素，众多研究人员对白血病的研究工作不断深入。模型动物实验作为药效学和药理学研究的最直接手段，是研究肿瘤性疾病发病、转移、药物筛选的重要手段[3-5]，同时在白血病研究中也起着关键性作用。

基于小鼠获取方便、饲养容易、成本低廉、发病时间长短适宜等[6]特点以及与人类在病理学、生物学、遗传学方面较为相近，使其成为最常用的白血病建模动物。另外，由于小鼠造血系统与人类存在相似之处[7]，并且人类白血病细胞可在免疫抑制预处理的小鼠体内增殖而引发小鼠白血病，因此国内外众多学者针对小鼠开发出不同的模型来研究白血病发病的病理病机及治疗方法。

1 白血病的分型及流行病学

按照发病缓急程度，白血病可分为急性白血病与慢性白血病，急性白血病以原始细胞和早期幼稚细胞为主，发病较急，病情严重，病程较短；慢性白血病以幼稚或者较成熟细胞为主，发病缓慢，病程可达数年之久。按照病变细胞系列分类，主要可分为髓系和淋巴系，其中，髓系按照细胞类型分又可分为粒、单、红、巨核系，淋巴系按细胞类型分又可分为T细胞系和 B细胞系[8-9]。同时每类白血病又分为更多不同亚型，例如急性髓系白血病（Acute Myelogenous Leukem ia，AML）按照 FAB的分类方法又可分为 M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M0 这八种不同亚型。据调查报道，白血病在我国恶性肿瘤的死亡率中居前列，男性居第六位，女性居第八位，而儿童和35岁以下成人则居第一位。在发达国家，白血病也是一种常见的致死疾病，其在美国、西欧等国家的发病率高于亚非洲国家。据美国国家癌症研究所（National Cancer Institute， NCI）统计[10]，2008到2012年这五年间，平均每十万人新增 13.3例白血病患者，平均每十万人有 7例患者死亡，患者还在不断增加。每个人一生中大约有1.5%的可能性会被诊断出患有白血病，2005年至 2011年的五年存活率只有58.5%，目前存活率还不高。近十年的白血病病例以0.2%的年均增长率增加，年均死亡病例24 450起，约占所有癌症死亡病例的4.1%，由此可见白血病仍然是一种对人类有着巨大威胁的疾病。

2 小鼠白血病模型的建立

2.1 自发模型

小鼠自发白血病模型的建立最为简单，某些品系的小鼠在生长过程中会自发白血病，只需在小鼠进行饲养过程中定期观察、筛选出发病的小鼠即可。常用的有C58小鼠、AKR小鼠，C58小鼠是在1921年MacDowell用 Abby Lathrop的近交系鼠配得到的，在6个月龄后大多数开始出现淋巴细胞白血病症状，发病率高达85%以上。AKR小鼠至6～9个月龄时[11]，白血病的发生率可达70% ～90%，多为胸腺来源的淋巴细胞白血病。AKR自发白血病小鼠，出生即带有致癌的RNA病毒，对药物的治疗反应类似儿童急性淋巴细胞白血病。

2.2 诱发模型

用来诱发动物白血病的化学致癌剂包括多环碳氢化合物如9，10-二甲苯并蒽和亚硝基脲类如丁基亚硝尿等。丁顺利等[12]利用7，12-二甲基苯蒽诱发BALB/c小鼠产生急性红白血病。最早利用病毒诱发白血病的研究是1951年Gorss应用AKR近交系白血病小鼠的无细胞提取液接种C3H近交系新生乳鼠诱发白血病，随后病毒与白血病的关系引起了人们很大的关注。Macdonald等[13]用8～12周龄CBA/H鼠，暴露于X线1次剂量3.0Gy，诱导小鼠白血病的产生。

2.3 移植模型

2.3.1 同源移植：同系动物肿瘤移植不产生免疫排斥现象。如可移植性小鼠白血病模型L615，先用T638病毒给新生的615近交系小鼠皮下或腹腔接种，发生白血病后，取白血病小鼠的脾或骨髓制成单细胞悬液给正常成年615小鼠皮下或腹腔接种，发病后再以同样的方法在615小鼠中连续传代建模[14]。研究人员把来源于 BABL/c小鼠的粒单细胞WEHI-3白血病细胞株通过静脉接种等注射途径均能在 BABL/c小鼠体内成功建模[15-17]。姚苗苗等[18]通过DBA/2小鼠腹腔注射P388细胞，抽取发病小鼠腹水后移植到其他正常DBA/2小鼠腹腔内，成功建立淋巴细胞白血病模型。何宏星等[19]将小鼠急性淋巴细胞白血病细胞L1210采用静脉、皮下及腹腔注射三种方式接种于DBA小鼠体内建立白血病动物模型，考察不同接种方法建立L1210白血病动物模型的成模情况。结果发现三种方式均能100%成功建立模型，可以根据实验指标的不同需求选择相应的移植方式。DBA小鼠是P388及L1210的特异宿主小鼠，是建立急性淋巴细胞白血病最理想的动物[20]。上世纪美国国家癌症研究所曾用此两种模型筛选了40万种化合物。另外，移植时可结合注射肾上腺皮质激素、抗肿瘤药物和适量放射等方法，降低宿主免疫排斥反应，提高建模成功率。

2.3.2 异源移植：异源移植常用于人源肿瘤移植于动物体内表达，所建成的模型即为人源肿瘤移植模型（PDX模型）[21]。传统异源移植是指将人源细胞在体外经过筛选建立稳定细胞株后，再移植入动物体内。PDX模型是近来研究人员发现的异源移植的新移植方式，通过将临床获取的新鲜肿瘤组织或细胞原位或者异位接种于动物来建立模型。这种模型充分保留的原发肿瘤的生物学特性以及生长环境，因此最为接近临床[22]。但血液系统肿瘤由于多数无实体肿瘤，因此很难建立PDX模型。异源移植多发生免疫排斥现象，可能会导致白血病异种移植失败，可通过化疗药物和照射等的预处理抑制小鼠免疫功能，但建模较为麻烦。免疫缺陷小鼠的发现及应用大大提高了该类动物模型建立的成功率。1983年 Bosma等[23]首先发现了 C.B-17纯系小鼠16号染色体上的重症联合免疫缺陷（severe combined immunod-eficiency，SCID）基因隐性突变后，小鼠T淋巴细胞和 B淋巴细胞功能缺失，因此得到SCID小鼠。由于SCID小鼠体内尚存在部分非特异性免疫功能，造模过程中可能出现免疫逃逸现象。1992年 Prochazka等将 SCID小鼠与非肥胖型糖尿病小鼠（NOD/Lt）回交得到非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠[24]，该小鼠的NK细胞功能也是缺陷的[25-26]，使得建模成功率大幅提升。国外有研究人员将K562细胞植入NOD/SCID小鼠后，成功建立红白血病模型[27-28]。魏玉娜[29]通过 NOD/SCID小鼠尾静脉注射 HL-60细胞的方法，成功建立了急性早幼粒细胞白血病模型。随着科研人员的不断探索NOD/SCID IL-2 receptor gamma null（NSG）小鼠成为了目前为止免疫缺陷程度最高的小鼠。开始在肿瘤性动物模型建立的科学实验中推广应用。Saland等[30]研究人员将人源AML细胞株通过尾静脉注射到经全身照射或20 mg/kg腹腔注射马利兰预处理的NSG小鼠体内，成功建立起一种高效和快速的异种移植动物模型来进行白血病的相关研究工作。

2.4 遗传修饰小鼠模型

2.4.1 转基因模型：1976年美国科学家 Jaenisch等利用反转录病毒把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因组，建立了世界上第一个白血病转基因小鼠品系，随后又有研究将vtAT与强力霉素结合，从而抑制四环素操纵子调控基因的时相表达，由此成功构建了Bcr-Abl阳性的 CML模型[31-32]。Carron等[33]将TEL基因与胞浆激酶JAK2融合的基因（TELJAK2）的cDNA置于EmuSRalpha增强子/启动子转录调控的下游产生转基因小鼠白血病模型，将TEL-JAK2白血病细胞移植到小鼠体内仍具有致瘤性。Ohtaki等[34]用人 T细胞白血病病毒-1型（HTLV-1）基因，成功建立了转基因小鼠。TCL-1转基因小鼠是目前应用最为广泛的CLL动物模型，McClanahan等[35]通过构建TCL-1小鼠来模拟 CLL患者体内的免疫缺陷，并采用过继转移PD-L1封闭性抗体治疗发生CLL的TCL-1小鼠，最终成功阻止了CLL的发展，同时观察到免疫效应功能的重新激活。MiRNA29也是CLL的预后指标之一，它在CLL患者中高于正常，且惰性CLL中高于侵袭性 CLL。Pekarsky和 Croce[36]为进一步研究 MiRNA29的作用，在2010年构建了MiR-NA29转基因小鼠模型，这些小鼠的B细胞中过表达MiRNA29。他们通过该模型研究发现MiRNA29的作用靶点可能是肿瘤抑制因子-过氧蛋白。

2.4.2 基因敲除模型：1987年，Thomas和Capecchi的研究小组根据同源重组的原理试验了哺乳动物细胞中导入基因的定点整合[37]，即基因打靶技术。而利用胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）同源重组的传统基因打靶技术在目前基因敲除研究中仍然重要[38]。Khanna通过胚胎干细胞打靶技术建立的ATM（A-T突变基因）白血病淋巴瘤动物模型[39]。Kawagoe等成功敲除 MN1-TEL融合基因，构建成AML小鼠模型，用于研究MN1-TEL对白血病的作用机制。Carella构建了 CBFβ-SMMHC基因敲除小鼠，并用于研究 CBFβ-SMMHC致 AML发生的机制。Fedorchenko等[40]为了研究 CD44在CLL中的作用，将 TCL-1小鼠与 CD44基因敲除小鼠杂交，得到 Eu-TCL-1：CD44-/-小鼠，这些小鼠表达低水平的抗凋亡基因MCL-1以及减弱的BCR激酶反应。

2.5 逆转录病毒介导的骨髓移植模型

逆转录病毒载体基因组含有编码病毒功能蛋白的结构基因及复制、整合、RNA转录及包装所必需的顺式作用区。将编码病毒功能蛋白的结构基因切除，插入白血病基因即构成了完整的逆转录病毒载体。将该载体导入包装细胞，培养出具有感染能力的高效价逆转录病毒，用该病毒感染小鼠骨髓造血干细胞，移植到经免疫抑制处理的同种小鼠体内，通过综合小鼠多项指标判定小鼠发病情况。虽然逆转录病毒法建立的模型严格上讲也属于基因修饰模型，但该方法既包括了准基因技术，也包括了移植技术，故本文将其单独分为一类。

最早用该方法的是1990年，Daley等[41]利用BCR-ABL基因建立了发病率较低的CML模型。随后研究人员通过优化实验条件[42]建立了众多 AML相关的逆转录病毒介导的小鼠模型，2002年Guzman等[43]建立了 AML1-ETO模型，2006年以来众多研究人员用该方法建立模型，Yan等[44]建立了AML1-ETO9a模型，Palmqvist等[45]建立了 NUP98-HOX，以及MLL相关融合基因的逆转录病毒介导的小鼠模型等。Hasegawa等[46]通过该方法成功建立了稳定的MLL/AF9白血病模型。

采用逆转录病毒为载体，将某些致病基因导入小鼠体内，并在小鼠体内稳定表达，建立起来的动物模型更为典型的代表了临床白血病患者的真实情况，对优化治疗方案，研发更具疗效的新药提供了有利的工具。

3 白血病动物模型检测技术的发展

目前常用的检测小鼠白血病的方法有动物一般生活情况观察，系统解剖学和病理学观察组织器官病变程度，小鼠外周血象、骨髓像及脾脏细胞形态学检查，还可用流式细胞仪分析小鼠骨髓和脾脏细胞表面抗原的改变，Cheng等用流式细胞术证明了AML患者骨髓细胞存在 CD33、CD123[48]。随着技术水平的不断提高，白血病模型动物建立的方法越来越多，传统的鉴定成模的试验方法和指标已经不能完全代表小鼠发生白血病的真实情况，尤其是基因修饰建立的动物模型，并且有些传统鉴定方法相对落后。为了更直观、准确地判断动物模型是否成功，在某些基因修饰模型中，采用RT-PCR检测目的基因的表达和Western Blot检测移植目的蛋白的表达的方法，能够准确说明白血病基因在小鼠体内是否存在和表达，此方法也成为目前为止基因修饰小鼠模型中最可靠的检测手段。

4 结语

在白血病的研究工作中，采用小鼠白血病模型，既能在很大程度上说明研究成果，又避免了人体试验所承受的巨大风险，为白血病的研究工作提供了安全可靠的手段。另外小鼠造血系统和遗传学特性与人类存在相似性，在探究白血病的发病规律、治疗方案、预后判断等方面，使研究结果能够接近于人。小鼠价格低廉，易于饲养，操作方法成熟，使得其成为理想的模型动物之一。