流式细胞术用于白血病外周血细胞检测对急性白血病复发判断的意义

葛丽卫， 王笑颜

（1.解放军第九八医院，浙江 湖州 313000；2.湖州市中心医院，浙江 湖州 313000）

急性白血病（acute leukemia，AL）是典型的非实体肿瘤，随着工业污染的加剧和社会环境的改变，AL的发生率及死亡率逐年增加，严重地影响了患者及其家庭的生活质量。随着AL治疗方案的不断改进，AL的治疗水平不断提高，初治AL患者有了较高的缓解率，但仍存在复发的可能[1]。目前临床认为引起AL复发的主要因素是患者在完成治疗后体内仍残留一定的肿瘤细胞即微小残留病变（microresidual disease，MRD），这些肿瘤细胞仍能继续增殖，导致疾病复发[2]。一般而言，AL细胞属于表面抗原表型，具有异常光散射的特点，因此能够通过流式细胞术（flow cytometry，FCM）、单克隆抗体来检测细胞表面不同抗原的荧光信号进行识别。我们就FCM检测外周血细胞检测对AL复发判断的意义进行了分析。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年1—12月解放军第九八医院收治的142例AL患者，其中男76例、女66例，年龄22～68岁。排除急性早幼粒细胞白血病患者，分型包括急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）88例和急性淋巴白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）54例，诊断符合法美英（French-American-British，FAB）诊断标准。本研究经医院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

采用FCM对患者外周血标本进行检测。采集患者空腹静脉血3 mL，用乙二胺四乙酸二钾抗凝，采用藻红蛋白、多甲藻叶绿素蛋白、异硫氰酸荧光素、别藻青蛋白4种荧光剂进行免疫标记并进行免疫分型检测。每支试管加入1×106有核细胞，根据患者的白血病特点选择合适的单克隆抗体，所有单克隆抗体均由美国BD公司提供，操作严格按照试剂说明书进行。至少收集10万个可供分析的有核细胞，采用美国BD公司生产的FACSCalibur流式细胞仪进行细胞收集，并采用配套软件进行分析。根据原始细胞抗原是否跨系表达、表达是否同步、表达强弱、表达是否丢失等判定是否为MRD，当MRD≥0.01%时视为MRD阳性，否则则视为阴性。同时以所有患者骨髓细胞形态学检验结果作为对照，骨髓液涂片6～8张，吉姆萨-瑞氏染色后在显微镜油镜下分类200个细胞，根据形态进行分类计数，参照《血液病诊断及疗效标准》[3]中的相关内容判定是否复发。

1.3 指标观察

以骨髓细胞形态学检验结果为金标准（世界卫生组织诊断标准，增生Ⅰ～Ⅱ级，原始细胞增多≥20%），对比FCM检测的敏感性及特异性。随访12个月，统计患者的复发率，分析MRD阳性、阴性与复发率的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料用百分比（%）表示，组间比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FCM检测结果

用FCM检测AML患者88例，检测敏感性为96.6%，特异性为33.3%；用FCM检测ALL患者54例，检测敏感性为88.9%，特异性为44.4%。见表1。

表1 FCM检测AL的敏感性及特异性 [例/例（%）]

2.2 MRD与复发率的相关性

24例MRD阴性患者中有6例复发，复发率为25.0%，118例MRD阳性患者中有88例复发，复发率为74.6%，MRD阳性患者复发率显著高于阴性患者（P＜0.05）。

3 讨论

FCM的免疫分型是目前AL研究的基本手段之一，其能够通过对MRD的检测来进行预后判断[4]。有学者研究显示，诱导治疗能够杀灭绝大多数的AL细胞，但难以彻底清除，部分患者会在化疗缓解后仍表现出MRD阳性直至复发，因此认为MRD阳性是评估化疗缓解程度的重要因素[5]。临床上对于AL的诊断和疗效的判断主要通过骨髓细胞形态学检测，虽然细胞学检测能够作为AL的诊断金标准，但仍存在一定的局限性，如每次骨髓穿刺获取的标本只能反映出该部分的骨髓情况，而且一般在患者体内AL细胞数量＞1%时方能检出[6]，而MRD则会持续存在并在外周血中有所体现，通过对MRD的检查能够更全面地反映AL患者的预后情况。此外，对于患者而言，骨髓穿刺的创伤性较大，而外周血取材较为方便，在这方面FCM检测也具有一定的优势。

本研究结果显示，FCM对AL患者外周血检测具有较高的敏感性，对AML和ALL检测的敏感性分别为96.6%和88.9%。BUCCISANO等[7]将115例AML患者的外周血作为MRD的检验对象，提示MRD的表达与患者的长期预后密切相关。本研究结果亦表明，24例MRD阴性患者中有6例复发，复发率为25.0%，118例MRD阳性患者中有88例复发，复发率为74.6%，MRD阳性患者复发率显著高于阴性患者（P＜0.05），这提示MRD阳性可能与骨髓中AL细胞的持续存在有关。但由于本研究随访时间仅为12个月，有30例患者持续提示MRD阳性但骨髓细胞形态学检验并未得出复发的结果，仍需作进一步随访。但目前数据已经能够提示MRD阳性患者具有极高的复发概率，在化疗后仍需追踪观察，这也反映了MRD是一个提示AL预后的重要因素。COUSTAN-SMITH等[8]的研究也显示以MRD 0.01%为界限，水平＞0.01%的患者3年复发率是水平＜0.01%患者的3倍以上，因此认为可以根据MRD检验水平来进行预后分级，并积极采取预防化疗方案，如果MRD持续阴性则可以停止治疗，如果MRD持续阳性则考虑改变化疗方案、增强化疗或进行骨髓移植[9]。有研究对外周血和骨髓中的MRD水平进行了对比，结果发现二者会因为疾病类型、治疗方案甚至检验时间的不同而发生变化，但一直保持一定的比例关系[10-12]。PAWINSKA等[13]的研究认为AL患者的外周血MRD检测与骨髓检测具有相同的意义，同时进行外周血和骨髓MRD检验能够有效提高检出率。有学者研究发现ALL患者的外周血和骨髓MRD检验结果具有较好的一致性，虽然骨髓检验的检出率要略高于外周血，但采用外周血MRD检验同样可以用于评价ALL患者的预后情况[14-15]。

综上所述，FCM检测AL患者外周血细胞具有较好的敏感性，在AL复发率评估中也有一定的临床意义。

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