多位点序列分析法在白念珠菌性阴道炎唑类耐药菌株分子流行病学研究中的运用

徐炜新， 孙 杰

（上海市嘉定区中心医院检验科，上海 201800）

念珠菌性阴道炎是妇女的一种常见病、多发病，其主要的病原体为白念珠菌。目前，白念珠菌已成为阴道炎的第二大致病因素，仅次于细菌感染[1]。白念珠菌性阴道炎如不及时进行有效的治疗，除会出现持续性阴道瘙痒，严重影响生活质量外，还可导致宫颈糜烂、输卵管炎、盆腔炎等女性生殖道的多发性炎症，继而影响精子活力，诱发不孕，极少数患者甚至会发生早产或胎儿发育不良等严重后果[2]。

以氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑为代表的唑类抗菌药物是治疗白念珠菌性阴道炎的常用药物。然而，随着临床应用的日益广泛，唑类抗菌药物的耐药率逐渐升高[3]，这种耐药现象的增加往往伴随着菌种基因型的变化。基因分型是分析病原体种群结构和流行性的常用方法，能有效进行传染源追踪、暴发流行分析、种群动力学研究等一系列流行病学研究。1998年，MAIDEN等[4]建立了多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST）法，能对核苷酸的序列多态性进行高效分析。该方法现已被广泛应用于多种病原微生物的基因分型检测。本研究采用MLST法对白念珠菌性阴道炎患者白带样本中分离出的白念珠菌临床菌株进行基因型分析，探究其分子生物学流行特征和遗传变化趋势。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集上海市嘉定区中心医院妇产科2015年7月—2016年6月白念珠菌性阴道炎患者的白带样本中分离出的白念珠菌，其中60株对氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑中的1种或多种药物耐药；敏感菌株的入选采用随机化原则，即选取菌株编号末尾为5的对3种唑类药物均敏感的菌株，共38株。

入选标准：患者处于非月经期，外阴有瘙痒感，外阴湿疹化，肿胀而有刺痒感，有瘙抓痕迹；白带量多并有臭味，黏稠呈奶酪样、豆腐渣样或白色片状；可有肿胀并有烧灼感，或有排尿困难和疼痛；阴道壁有白色伪膜状物，且不易脱落；新鲜样本不经染色，在显微镜下用10%氢氧化钾涂片镜检可见菌丝或孢子。

排除标准：患有肿瘤、严重肝肾功能不全等器质性疾病者；合并滴虫、支原体、衣原体等感染者；就诊前1个月内进行过抗真菌治疗的患者。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养与鉴定 将白带样本接种于科玛嘉显色平板（法国CHROMagar公司）上，于35℃、5%CO2环境中培养24～48 h，观察结果。挑取科玛嘉显色平板上的翠绿色菌落，使用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司）进行菌种鉴定。

1.2.2 体外药物敏感性试验 选用氟康唑（上海三维制药厂）、伏立康唑（上海三维制药厂）和伊曲康唑（美国Sigma公司）3种唑类药物进行药物敏感性试验。以白念珠菌（ATCC 90028）和克柔念珠菌（ATCC 6258）作为质控菌株。药物敏感性试验的判断标准见表1。

表1 氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的最低抑菌浓度折点 （μg/mL）

1.2.3 菌株DNA的提取、扩增和测序 临床分离的白念珠菌在沙保弱培养基（上海伊华医学科技有限公司）上复苏培养后，采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒[生工生物工程（上海）有限公司]提取DNA，具体操作参照试剂说明书进行。抽提完成后使用NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）测定抽提到的DNA浓度，并用双蒸水将其终浓度稀释至100～200 ng/μL，-20 ℃保存备用。采用白念珠菌的7个管家基因进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，反应体系为50 μL，包括DNA模板2 μL，正、反向引物各2 μL，2×PCR mix 25 μL，双蒸水19 μL。扩增条件：93 ℃预变性5 min，93 ℃变性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30个循环，72 ℃延伸4 min。反应体系中除引物由生工生物工程（上海）有限公司合成外，其他试剂均由日本Takara公司生产。S100TM Thermal Cycler PCR仪由美国Bio-Rad公司生产。PCR产物经电泳验证后，送至铂尚生物技术（上海）有限公司测序。7个管家基因的引物序列见表2。

表2 白念珠菌7种管家基因的引物序列

1.2.4 测序结果分析和序列类型（sequence type，ST）确定 采用Chromas 2软件对所有菌株7个管家基因的测序结果进行分析，比对色谱图和测序结果，找出杂合碱基，再将整理好的序列提交至MLST数据库网站（https：//pubmlst.org/calbicans/），与其相对应的等位基因进行比较，获得每一个管家基因的位点编号。如此依次得到每一株菌株的全部7个管家基因的位点编号，最后将这一组位点编号再次提交至该网站，获得其给出的ST。

1.2.5 遗传多样性和亲缘性分析 （1）ST数与菌株数的相关性分析：采用SPSS 20.0软件分别对耐药菌株组和敏感菌株组的ST数与菌株数按季度分组，然后进行一元线性回归分析。分别计算2个组的ST数/菌株数比值，然后进行χ2检验，判断其是否有差异。（2）聚类树的构建：将所有菌株7个管家基因的等位基因位点编号组成数据组后录入BioNumerics 7.6软件，采用categorical法计算相似性系数，采用非加权组平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）构建聚类树。（3）最小生成树的构建：采用BioNumerics 7.6软件，以categorical法计算相似性系数，构建最小生成树。在最小生成树中，一个圈代表一个ST，圈的大小代表菌株数量的多少，圈旁的数字代表MLST type（ST），圈之间连线上的数字代表2个ST之间相同等位基因的数量，相同阴影下的圈属于同一个ST群。

2 结果

2.1 MLST结果

耐药菌株组共有14种ST，其中9种共55株菌株MLST数据库已登记，剩余5种共5株菌株可能为新的ST。耐药菌株组主要的ST为ST310（18株）、ST1364（11株）、ST2551（11株）和ST135（9株），ST数/菌株数比值为0.23。敏感菌株组共有19种ST，其中12种共31株菌株MLST数据库已登记，剩余7种共计7株菌株可能为新的ST。敏感菌株组主要的ST为ST2048（7株）和ST1474（6株），ST数/菌株数比值为0.50。将未从MLST数据库获得ST的菌株的ST暂命名为ST new1～ST new12，敏感菌株为ST new1～ST new7，耐药菌株为ST new8～ST new12。2个组ST数/菌株数比值差异有统计学意义（P＜0.05）。由此可见，耐药菌株组ST的集中程度高于敏感菌株组。耐药菌株组和敏感菌株组中MLST数据库已登记的ST主要型别经7个管家基因扩增后得到的等位基因位点编号见表3。

2.2 ST数与菌株数的相关性分析

敏感菌株组和耐药菌株组的ST数与菌株数在样本不同收集时段（按季度分）的数量见表4。相关性分析显示耐药菌株组和敏感菌株组的ST数与菌株数均呈线性正相关关系（耐药菌株组：r=0.995，P=0.005；敏感菌株组：r=0.989，P=0.011），见图1。无论是敏感菌株还是耐药菌株，其ST的种类均随菌株数量的增加而增加，即耐药菌株和敏感菌株的基因型均呈现出多克隆性的特征。

表3 MLST数据库已登记的ST经7个管家基因扩增后得到的等位基因位点编号

2.3 亲缘性分析

敏感菌株组和耐药菌株组ST的最小生成树见图2。由图2可见，处于同一阴影下的ST其不同等位基因的数量不超过2个，显示其基因型具有较强的同源性。耐药菌株组只形成了1个集中的阴影，而敏感菌株组形成了多个分散的阴影，且耐药菌株组形成阴影覆盖的高同源性ST的菌株数量高于敏感菌株组，提示耐药菌株间的亲缘性要近于敏感菌株。

表4 各季度敏感菌株组和耐药菌株组的ST型数与菌株数

图1 敏感菌株组和耐药菌株组ST数与菌株数的相关性分析

2.4 聚类分析

耐药菌株组等位基因及ST的聚类树见图3。在敏感菌株组中，ST2048和ST1474为优势型别，分别包含7株和6株菌株。在耐药菌株组中，ST310、ST1364和ST2551为优势型别，分别包含18株、11株和11株菌株。由图3可见，耐药菌株的种群形成了多级分支，ST310、ST1364和ST2551同处于第1分支，ST135为第2分支，显示其主要ST之间形成了较为明显的聚类。

图2 敏感菌株组和耐药菌株组ST的最小生成树

图3 耐药菌株组等位基因及ST的聚类树

3 讨论

MLST法是建立在管家基因测序基础上的分型技术，具有较高的分型能力、可分辨率和良好的重复性，可有效地分析出病原体的分子生物学种群特征和遗传进化的演进过程。2002年，BOUGNOUX等[6]第1次将MLST法用于白念珠菌的分型研究。随后，多次改进其管家基因选择的组成，在综合了TAVANTI等[7]的研究成果后，BOUGNOUX等[8]得出了白念珠菌最佳的7个管家基因位点组合，即AAT1a+ACC1+ADP1+MPⅠb+SYA1+VPS13+ZWF1，这也成为以后大多数白念珠菌MLST研究采用的实验方案，同时也是本研究采用的方案。

本研究采用MLST法对从上海市嘉定区中心医院白念珠菌性阴道炎患者白带样本中分离的对唑类抗菌药物耐药的白念珠菌进行分子流行病学调查，发现的主要流行病学特征为：（1）无论是耐药菌株还是敏感菌株，其基因型均表现为多克隆性，这与郭雅莉等[9]的研究结果较为一致，而且这2种菌株都表现出随着菌株数量的增加，其基因型多样化趋势更为明显的特征，个别ST在耐药菌株组和敏感菌株组中均存在；（2）耐药菌株ST数/菌株数比值低于敏感菌株，因此其基因型集中度高于敏感菌株，这与王志恒等[10]的研究结果较为一致；（3）耐药菌株中几个主要的基因型之间均存在较近的亲缘性，而敏感菌株这个特征却不太明显，耐药菌株组的ST76、ST310、ST1364和ST2551形成的覆盖面较广的菌株之间最多有2个位点不同的ST群，这个情况在有关分离自白念珠菌性阴道炎患者的对唑类抗菌药物耐药菌株的ST研究中未见相同报道[9-10]；（4）聚类树是根据数据组特征计算各个菌株数据组的相似度，根据相似度来进行聚类，以此揭示菌株的ST及其聚类特征，并展示所有的菌株信息。聚类分析显示耐药菌株的第1聚类分支中的ST为ST310、ST1364和ST2551，这是菌株数量最多的3种ST。由此可见，本研究中对唑类抗菌药物耐药的白念珠菌的主要基因型别之间存在着较强的遗传同源性，即各菌株间可能存在相同或相似的耐药机制或耐药基因[11]。

MLST法最大的优势就是通过在互联网上建立数据库实现信息共享，使不同实验室之间可以不通过交换菌种，仅需通过比对数据库内的信息就可发现各自调查范围内的病原体的分子流行病学特征，并能通过新增数据信息，发布各自发现的新基因型。

综上所述，本研究采用MLST法分析了从上海市嘉定区中心医院白念珠菌性阴道炎患者白带样本中分离的白念珠菌的分子流行病学特征，发现敏感菌株组与耐药菌株组之间ST分布存在明显差异，且2个组之间ST分布集中程度也不同。通过MLST数据库将本研究结果与其他研究结果进行比对，发现本研究收集到的菌株，尤其是耐药菌株的ST与其他研究发布的ST有一定的差异。由此可见，同种病原体在不同地域之间的流行特征有一定差异，可为临床医生诊断和治疗该类疾病提供更多的参考。

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