慢性胃肠黏膜损伤树鼩模型建立的探索

叶尤松，高家红，赵 汝，李哲丽，王陈芸，马开利*，唐东红*

(1.中国医学科学院，北京协和医学院医学生物学研究所，昆明 650118； 2.云南农业大学动物医学院，昆明 650201)

胃肠黏膜损伤导致的胃肠疾病是一种临床上常见的急、慢性消化系统疾病，常反复发作，给患者的身心健康带来极大的危害，建立理想的胃肠黏膜损伤性消化道动物模型，对探索该病的病因、发病机制、病变发展规律，明确治疗方法及研发新药均有积极意义。目前报道的胃肠黏膜损伤动物模型造模方法主要有：应激性造模、药物造模、乙酸或乙醇致胃溃疡模型等。早期有研究者采用能选择性破坏中脑黑质多巴胺能神经元的毒性物质1-甲基-4-苯基-l, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP)，腹腔注射大鼠后导致其胃、十二指肠黏膜损伤和溃疡[1-2]。用于胃肠溃疡动物模型研究的实验动物，主要有大、小鼠等啮齿类动物，由于啮齿类与人类神经系统差别较大，建立一种费用相对低廉，能更好模拟人类神经精神因素影响所致胃肠黏膜损伤的发生、愈合及复发的动物模型，为研究胃肠病神经机制提供更理想的动物模型很有意义。树鼩(Tupaiabelangeri，tree shrew)的遗传学研究表明其在生物学上比啮齿类动物更接近灵长类动物，有着明显大于大鼠的大脑和更高级的神经系统，应用树鼩进行神经系统疾病研究有良好的前景[3]。与灵长类动物相比，树鼩又具有体型小、繁殖能力强的特点，在实验操作上也更为简便，但目前尚无利用树鼩成功制作胃肠疾病模型的报道。因此，本实验选择长期低剂量腹腔注射MPTP的方法，尝试用树鼩制作胃肠黏膜损伤模型，探索其可行性，为探索树鼩神经精神因素导致的消化系统疾病模型的开发和利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

12只滇西亚种普通级雄性树鼩，体重(153±6) g，12～18月龄，实验所用树鼩均由昆明医科大大学提供 [SCXK (滇) K2013-0002]，实验在中国医学科学院生物医学研究所完成 [SYXK (滇) K2014-0007]，并按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

甲醛、苦味酸和冰醋酸(重庆川东化工有限公司化学试剂厂)；Bouin液由苦味酸饱和液75 mL、福尔马林25 mL和冰醋酸5 mL配制而成；戊巴比妥钠，用时配制成1%的水溶液，每只树鼩按100 g体重0.2 mL剂量进行腹腔注射；MPTP(购自美国Sigma公司)，用时用生理盐水配制成浓度为1 mg/mL的溶液；三氯乙酸(购自上海沪震实业有限公司)。Nikon SMZ1500尼康高级体视显微镜，日本Hitachi Himac CT15RE高速离心机，美国安捷伦高效液相色谱仪Agilent 1100，日本岛津AY220电子分析天平，德国徕卡病理系统(Leica Biosystems)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与模型诱导

选取成年健康雄性树鼩12只，随机分为3组，每组4只，分别为2 mg/kg剂量组、1 mg/kg剂量组和对照组。早餐后，2 mg/kg剂量组腹腔注射MPTP 2 mg/(kg·d)，1 mg/kg剂量组腹腔注射MPTP 1 mg/(kg·d)，对照组腹腔注射等体积生理盐水，连续56 d。

1.3.2 一般情况观察

实验过程中每天观察各组动物精神状况、活动、饮食、粪便、毛色以及体重等情况并做相应记录，每周称量体重一次。

1.3.3 测定指标

56 d后，采用1%戊巴比妥钠溶液按每100 g体重0.2 mL剂量对树鼩腹腔注射麻醉，待树鼩麻醉后采集脑脊液，用高效液相色谱仪测量脑脊液中多巴胺(dopamine)含量。

1.3.4 病理学检查

脑脊液采集完成后，脱臼处死树鼩，剖腹，从幽门和贲门部截取整个胃，从幽门后1 cm处截取十二指肠，用双面刀片沿胃大弯剖开胃，纵向剖开十二指肠，用注射器吸取Bouin液冲洗胃和十二指肠内壁，擦去内容物，用体视显微镜观察胃前壁内侧面、胃窦与肠内壁，并拍照做记录，之后分别取胃体、胃窦、十二指肠三部分继续置于Bouin液中固定，常规石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色，观察胃肠组织形态学变化。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况的观察结果

2 mg/kg剂量组腹腔注射MPTP [2 mg/(kg·d)]后，其中有2只树鼩先后出现了一过性、暂时性的急性帕金森综合征症状(如：行动缓慢，反映迟钝，四肢无力，步态不稳，不能站立)，2只树鼩之间表现强弱略有细微差异，均在每天给药后持续约5 min左右，之后恢复正常。但上述帕金森症状是只有在腹腔注射MPTP之后才会出现的急性症状，而且此症状持续一周之后就不再出现。其它指标和其它树鼩相同，即腹腔注射后至第3周末，精神状态、毛色、排粪尿正常，但食欲下降，活动量减少，第4周开始对照组逐渐恢复正常，模型组依旧活动量少，食欲明显下降，毛皮蓬松没有光泽，排粪时好时坏，部分树鼩粪便呈黑色。

2.2 树鼩体重变化情况

每周称量体重一次发现，1 mg/kg剂量组和2 mg/kg剂量组从开始至第8周体重均出现逐渐下降趋势；对照组从实验开始到第4周出现体重下降，第4开始逐渐上升直至恢复，如图1所示。

图1 树鼩体重变化情况Fig.1 Changes in body weight of the tree shrews

2.3 树鼩脑脊液中多巴胺含量检测结果

多巴胺含量检测结果显示(见表1)，模型组树鼩脑脊液多巴胺含量均比对照组树鼩的多巴胺含量明显减少(P< 0.05)；1 mg/kg剂量组和2 mg/kg剂量组比较差异无显著性(P> 0.05)。提示注射MPTP能选择性破坏树鼩中脑黑质多巴胺能神经元，使树鼩脑脊液中多巴胺含量明显降低。

Tab.1Dopamine contents in cerebrospinal fluid of the tree shrews

组别Groups多巴胺含量Dopaminecontents对照组Controlgroup33466±33431mg/kg剂量组1mg/kggroup22857±3406Δ2mg/kg剂量组2mg/kggroup25343±5258Δ

注：与对照组比较，ΔP< 0.05。

Note. Compared with the control group,ΔP< 0.05.

2.4 形态学观察结果

2 mg/kg、1 mg/kg剂量组肉眼均可见树鼩胃肠外形大小、颜色正常；也可观察到胃肠道表面布满淤血，内容物呈黑色。体视镜下两组均有不同程度的胃肠黏膜损伤，具体表现为，胃黏膜局部充血或有弥漫性出血点，内壁上多处红肿出血，覆盖白色苔状物(如图2B)，或胃黏膜部分轻微脱落，多处呈异样粉红色，内壁上有零星散在轻微出血点(如图2C)，胃窦与十二指肠则表现为正常无异样状况；也有十二指肠黏膜颜色略微加深，覆盖白色苔状物，壁上多处红肿出血，或有散在出血点(如图2D)。但两组在胃肠黏膜损伤程度上没有明显区别；对照组肉眼和体视镜下观察，4只树鼩胃、十二指肠均无异常表现，胃内容物少，胃肠黏膜完整清洁，结构完整，大小、形态、颜色均正常。结果见图2。

注：A：对照组胃内壁；B、C：实验组胃内壁；D：实验组十二指肠。图2 体视镜下树鼩胃肠形态学变化(× 40)Note. A: Inner wall of the stomach in the control group. B, C: Inner wall of the stomach in the experimental groups. D: Duodenum in the experimental group.Fig.2 Morphological changes of gastrointestinal tract of the tree shrews observed by stereoscopy

2.5 HE染色结果

2 mg/kg和1 mg/kg剂量组大部分树鼩镜下见正常胃壁黏膜；胃体黏膜可见少许淋巴细胞及浆细胞浸润，部分表层黏膜脱落，少部分树鼩可见胃黏膜损伤明显，突出表现为黏膜下细胞水肿，部分胃黏膜结构紊乱，伴随有出血、脱落的坏死黏膜，或有粘膜上皮脱落，固有层充血，并有炎性细胞浸润，杯状细胞增多，粘膜下层充血水肿并有炎性细胞渗出，肌纤维间有大量炎性细胞浸润(如图3B)；胃窦部胃小凹粘膜上皮脱离，固有层出血，并有炎性细胞浸润，胃腺杯状细胞增多，少许树鼩肠腺上皮细胞发生化生，粘膜下层充血，有炎性细胞渗出，肌层细胞发生变性坏死(如图3C)；十二指肠粘膜上皮脱落，固有层充血，粘膜的杯状细胞增多，部分区域出现了炎细胞的慢性炎症改变，少许树鼩有固有层和粘膜下层的结缔组织增生，有多量淋巴细胞浸润(如图3D)，两组比较无明显区别。对照组树鼩胃肠主细胞、壁细胞形态正常，胃壁浆膜层、肌层、黏膜下层、黏膜层四层结构清晰完整，黏膜层腺体排列整齐。见图3。

注：A：对照组胃体；B：实验组胃体；C：实验组胃窦；D：实验组十二指肠。图3 树鼩胃肠病理变化(HE染色，× 400)Note. A: Gastric body, control group. B: Gastric body, experimental group. C: Gastric antrum, experimental group. D: Duodenum, experimental group.Fig.3 Pathological changes of gastrointestinal mucosa of the tree shrews. HE staining

3 讨论

胃肠道疾病是常见、多发病，常见黏膜损伤为其主要病变，心理因素及不良生活习惯均可诱发。随着生活节奏加快，不良生活习惯，以及社会、工作、家庭、心理负担加重，该病的发病率有逐年上升趋势[4-5]。建立一种理想而稳定的动物模型，模拟人类神经精神因素引起的胃肠疾病患者的病理病程、生理改变等特点，对人类胃肠病的研究很有必要。

MPTP是一种神经毒素，能选择性破坏中脑黑质多巴胺能神经元致动物体内分泌的多巴胺含量减少。多巴胺是一种源于酪氨酸的重要胃肠神经递质，参与人的情绪(感情、欲望)等调节，通过与胃肠道多巴胺受体(dopamine receptors，DR)结合参与胃肠道消化性溃疡的发生。因此，MPTP已经被认为是致实验动物溃疡病的毒性物质，大鼠腹腔注射后可导致胃、十二指肠黏膜损伤和溃疡[2,6-9]。本实验动物模型的建立，除了选择公认的试剂MPTP外，还选取了在生物学上比啮齿类动物更接近灵长类动物，有着比大、小鼠更高级的神经系统，又具有体型小、繁殖能力强，在实验操作上更为简便等特点的新型实验动物——树鼩作为模型动物[10-11]；采用小剂量、长期腹腔注射MPTP造模后，对照组和模型组树鼩给药后3周均出现活动减少、食欲下降、体重减轻情况，第4周后对照组树鼩体重、食欲和精神状况逐渐恢复正常，模型组从开始至第8周体重均呈逐渐下降趋势。结果表明，注射MPTP后，体内分泌的多巴胺含量变化，导致胃肠生理功能，包括胃肠运动和营养物质的吸收等出现紊乱。

造模后一般观察结果及树鼩脑脊液多巴胺检测结果表明，MPTP能在中枢和周围神经系统选择性地作用于多巴胺能神经元，引起这些神经元破坏，多巴胺含量减少，导致迷走神经功能紊乱和出现类似于帕金森病的症状，结果和已报道的观点相一致[12-13]。结果显示，帕金森症状只在高剂量组[2 mg/(kg·d)]动物一过性出现，提示2 mg/kg剂量可能是树鼩MPTP给药的临界点。

本实验模拟了人用胃镜形态学观察原理，体视镜下观察树鼩胃肠形态学变化，并综合一般观察、树鼩脑脊液多巴胺检测及树鼩胃肠病理组织学观察，结果表明：通过小剂量[1～2 mg/(kg·d)]长期腹腔注射(8周)神经毒物质MPTP，致树鼩胃肠黏膜损伤模型，在很大程度上能模拟人因精神因素而导致的胃肠黏膜损伤慢性发病进程，造模方法可行，理想给药剂量为2 mg/(kg·d)。由于种属特异性的原因，树鼩胃泌素、胃动激素等激素的检测尚无公认的检测方法，相关数据的观察有待进一步研究和探讨。

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