从克隆猴到基因编辑猴

汤波

2018年1月25日，一则爆炸性新闻覆盖国内外各大主流媒体，更是刷爆微信朋友圈——世界首批体细胞克隆猴“中中”和“华华”在中国诞生。这一近20年没能攻破的世界性难题，被中国科学院神经科学研究所孙强团队历时5年一举拿下。克隆猴的研究论文发表在国际权威学术期刊《细胞》上，这一成果也被誉为“世界级重大突破”，有人甚至将其与世界第一只体细胞克隆哺乳动物——“多莉”绵羊相提并论。更为重要的是，体细胞克隆猴的诞生将为规模化研制转基因猴和基因编辑猴提供便利，对研究人类神经疾病致病机理和筛选新药，都具有重大的意义。

克隆羊最有名

1997年2月22日，世界各大媒体争相报道一只名叫“多莉”的绵羊。这只绵羊非比寻常，它竟然不是由受精卵发育而来的，而是依靠3只母羊。

原来，科学家从一只6岁芬兰白面母绵羊的乳腺中取出乳腺上皮细胞，将细胞核从细胞质中分离出来，同时从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即去除其细胞核，然后将白面母羊的乳腺上皮细胞核移植到去核的苏格兰黑面母羊卵细胞中，采用电击刺激，使它重组细胞复活并开始分裂，继而发育成胚胎，然后又移植到另一只代孕母羊子宫内，“多莉”绵羊就这样诞生了。这一过程正是体细胞克隆，“多莉”也成为世界上第一只体细胞克隆的哺乳动物。

克隆绵羊“多莉”的诞生，打破了人们对生命的认识局限。传统的生物学教科书告诉我们，动物体包括体细胞和性细胞，性细胞只有两种，分别是精子和卵细胞，只有精卵结合为受精卵，才可能形成胚胎，再造生命。而体细胞则多种多样，都是已高度分化的细胞，包括神经细胞、免疫细胞、血红细胞、肌肉细胞和皮肤细胞等。体细胞就像机器人被设定了程序一样，只能执行特定的功能，不再具有分化并发育成个体的能力。例如，血红细胞只负责运输氧气，不具有神经细胞处理神经信号的功能。而“多莉”绵羊的出生，证明体细胞也具有再分化能力，即通过重新设定程序，体细胞也可以变成同一物种的其他任何细胞，甚至发育成一个活的动物体。

“多莉”绵羊也成为世界上最有名的羊，但之所以引起广泛关注，还有一个重要原因：人们担心克隆人的出现。有些人担心克隆人不健康，有些人担心克隆人身份混乱，还有人担心有坏人利用克隆人来生产器官，或代替自己从事犯罪或恐怖活动。不过20多年过去了，体细胞克隆人并没有出现，因为科学家们对研究克隆人根本没有兴趣，各国也相继出台法律嚴禁克隆人。

相反，倒是其他动物物种不断被克隆出来，目前已成功克隆的动物包括小鼠、牛、猪、猫、兔、狗、狼、雪貂等20多种。体细胞克隆技术的应用前景也不断被挖掘出来，如复活已死亡或灭绝的动物，保护濒危物种，大规模繁育高产优质种畜、生产人类疾病动物模型，甚至研制出克隆胚胎或细胞来治疗人类疾病等等。

克隆猴不简单

由于与人类亲缘关系最近，猴子等非人灵长类动物是建立人类疾病模型的理想材料，美国、德国、日本、新加坡等国家的科学家一直希望能制备体细胞克隆猴，为开发人类疾病基因修饰猴奠定基础，但是经过近20年的努力，实验最终都失败了。

从“多莉”绵羊诞生以来，世界上的研究团队开展的体细胞克隆猴，大多数只做到了克隆胚胎早期之前的阶段，并没能将克隆胚胎移植到代孕母猴体内。只有2个实验室开展了胚胎移植实验，但也只是接近成功。

2004年，新加坡国立大学的科学家成功制备了一批猕猴的克隆胚胎，并将这些胚胎移植到了30多只代孕母猴体内，用超声波检测发现其中有7只怀孕，但是这些胚胎在母猴体内的存活时间最终均没能超过60天。2010年，美国俄勒冈灵长类研究中心也开展体细胞克隆猴的研究，采用与克隆羊“多莉”类似的技术路线，获得67枚发育良好的克隆胚胎，并将这些克隆胚胎移植到10只代孕猕猴子宫内，之后检测到其中有5只怀孕，但是只有1个活胎。不幸的是，最后这个胎儿也在81天时流产了。

经历多次失败后，很多科学家都认为，现有体细胞克隆技术无法生产出克隆猴，问题到底出在哪儿呢？原来用体细胞克隆猴主要存在以下3个难点：一是猴卵母细胞不透明，在显微镜下，肉眼无法识别出细胞核和细胞质，因此卵母细胞去核难度非常大。二是猴的卵母细胞容易提前激活，就是稍微有一点刺激，卵母细胞就启动分裂。但是新植入的体细胞核是个“外来户”，还没有摸清楚情况，卵母细胞就已开始分裂，就导致新来的细胞核根本跟不上卵细胞分裂的速度，这样的克隆胚胎基本上无法存活。三是体细胞的细胞核与卵母细胞的细胞质毕竟不是“原配”的，被强行拉到一起后，开始时并不能互相接受，甚至还会相互排斥，大多数只能同归于尽，导致猴的体细胞克隆胚胎发育差，可用于胚胎移植的优质囊胚比例较低。

前一个难点是技术问题，研究人员想到了一种给细胞照明的方法，而且不断完善猕猴的胚胎操作技术，练就了飞速去核的本领。后两个难题是关于猕猴胚胎发育的内在问题，研究人员借助一些药物，促进重组细胞核与细胞质融合，结果，很多重组胚胎奇迹般地复活了，优质克隆胚胎数量大幅增加。

2017年11月27日和12月5日，两只活泼可爱的体细胞克隆猴“中中”和“华华”终于出生了，它们是260枚克隆胚胎中顽强存活下来的幸运儿。从开始立项到克隆猴诞生，孙强团队总共历时5年多，也反映了用体细胞克隆猴的技术难度之大。

基因编辑猴才是目标

“中中”和“华华”一出生就被寄予厚望，科学家希望将体细胞克隆技术与基因编辑技术结合起来，研制出一批能模仿人类神经疾病的动物模型，借此研究这些疾病的致病机理，并筛选疗效显著的新药。

世界首批克隆猴

据预测，人类遗传病有7000种以上，包括一些神经系统疾病。人们对大多数遗传性神经疾病的致病机理并不清楚，药物研发因此相对滞后。科学家发现，通过基因编辑技术，如果将猴子的一些基因改造成与人类遗传性神经疾病的致病基因一样，这样的基因编辑猴就能变身为人类疾病动物模型，表现出这些神经疾病的症状，科学家就可以研究其机理并筛选新药。

不过，每一种新药被研发出来后，首先必须经过动物试验来验证其安全性和有效性，不同遗传背景的动物对药物的耐受能力和反应都不一样，因此进行动物试验前最好遴选与人遗传背景一致的动物。以前主要用小鼠或大鼠作为实验动物，但是这些啮齿类动物与人类的遗传背景、生理结构和药物反应等方面都存在较大差异，结果大多数在啮齿类动物体内有疗效的药物，一旦运用到人体临床试验却宣告失败。

基因编辑技术能将猴子的一些基因改造成人类致病基因，使其表现出人类遗传病的症状。而体细胞克隆技术则可以大规模生产出遗传背景完全一致的基因编辑猴。由于猴子等灵长类动物是所有实验动物中与人类亲缘关系最近的，因此一旦将体细胞克隆技术和基因编辑技术相结合，基因编辑克隆猴将成为最主要的人类疾病动物模型。

值得一说的是，在体细胞克隆猴诞生之前，我国科学家已率先在国际上培育出基因编辑猴，为研制更好的人类疾病动物模型奠定了重要基础。

基因編辑猴

2014年2月，《细胞》杂志网站报道了昆明理工大学季维智院士团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在中国昆明成功培育出了世界首例基因编辑猴。CRISPR/Cas9基因编辑技术是最新一代的基因编辑技术，含有负责寻找并特异结合目标DNA片段的向导RNA，以及负责切割目的DNA片段的“分子剪刀”——DNA切割酶Cas9。研究人员首先对猴的单细胞受精卵注射一种设计好的向导RNA，然后通过这种RNA引导DNA切割酶Cas9，对与新陈代谢调控和免疫系统疾病相关的2个基因同时进行破坏，最终获得了2只基因敲除的小猴。

此次培育体细胞克隆猴的孙强团队也已建立转基因猴和基因编辑技术平台，先后培育出自闭症转基因猴和CRISPR/Cas9基因编辑猴。而利用此次实验成功的体细胞克隆技术与基因编辑技术结合，就有望培育出更多、更有价值的人类疾病灵长类动物模型，为研究人类神经疾病机理、探寻脑疾病治疗方法和新药作出巨大的贡献。