膀胱出口部分梗阻动物模型的研究进展

陈 林, 杨亚飞, 杨 进, 何平林, 王 凯, 王云汉, 汪自力

(1. 成都大学附属医院泌尿外科, 成都610081; 2. 遵义医学院, 遵义 563000)

膀胱出口部分梗阻(partial bladder outlet obstruction,pBOO)是一种常见的慢性泌尿系统疾病，其特征表现是膀胱病理性肥大，胶原沉积和尿潴留[1]。pBOO可由多种病因引起, 包括良性前列腺增生, 尿道狭窄和前列腺术后的膀胱颈挛缩等[2,3]。受累人群非常广泛。以前列腺增生为例，流行病学研究表明, 70岁及以上的男性患病率最高[4], 26.2%的男性患者一生中会罹患不同程度的前列腺增生[5]，随着我国人口老龄化加剧，该疾病的家庭负担和社会负担将极为严重。如果没有良好的药物或技术控制疾病，患者排尿功能障碍加重必然导致肾脏功能损害甚至尿毒症等一系列严重后果[6,7]。因此, 越来越多的研究者将目光转至膀胱梗阻性疾病的基础研究中，这对梗阻性膀胱疾病的发病机制研究具有重要现实意义。为了观察机体的整体状态，从现象到本质完整观察疾病的病理生理状态，合理使用动物构建疾病模型的方法仍然是不可替代的[8]。该领域近年来新报道较多，国内相关综述少且较陈旧[9],本文就pBOO动物模型的造模方法选择等研究进展进行综述。

1 膀胱颈结扎

自1982年以来，开放手术膀胱颈结扎法一直是构建pBOO动物模型使用最广泛也较为成熟的方法[10]。开放手术诱导的pBOO模型能够包含临床上所观察到的大多数临床特征。目前临床上诊断pBOO的金标准为尿流动力学检测[11]，其中压力-流率测定(pressure-flow study，PFS)常呈现“高压低流”的特点。有学者[2,12]应用膀胱颈结扎法在大鼠中成功构建pBOO动物模型，行膀胱充盈测压检测可见其膀胱压力曲线图示，具体方法如下: 动物称重后，腹腔注射或气体吸入麻醉, 仰卧位平放小鼠。碘伏消毒会阴处，将直径为1 mm的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱，以此作为尿道支撑，并发挥校准棒的功能。下腹部行纵行切口后逐层切开皮肤及皮下组织, 钝性分离出膀胱颈周围组织，仔细游离膀胱-尿道交界处，游离近端尿道，避免因误扎两侧输尿管引起上尿路梗阻或肾积水。近端尿道穿过3-0丝线, 结扎近端尿道, 拔除尿道内导管逐层缝合关闭腹部。目前对结扎膀胱颈造成pBOO模型所需校准棒的直径大小尚无统一的标准。雄鼠由于尿道外口暴露不明显而且尿道弯曲，其校准棒直径多在2 mm以内，雌鼠因其尿道外口暴露明显且尿道直，校准物的金属棒外径多为1 mm，雌鼠具有解剖简单，方便导尿的特点，因此国内外文献中动物模型造模以雌性为主。校准棒的放置位置目前也无统一标准，可通过导尿的方式经尿道插入导尿管，以导尿管作为校准棒，结扎缝合造成梗阻。也有将校准棒直接与雌鼠尿道紧贴，缝合尿道后抽出校准棒的方式建立模型，此种方式梗阻程度与校准棒直径呈正相关关系。该方法具有简便、可操作性强以及造模时间短的特点，是一种快速、简便的pBOO造模方法。

但是随着pBOO研究的广泛开展，学者们对膀胱颈结扎构建pBOO动物模型的稳定性和可重复性提出质疑，除传统的经膀胱颈构建pBOO动物模型高达15%的死亡率饱受诟病外[13]，开放手术相关的并发症可能损害膀胱血供并导致膀胱神经支配异常，也使这一传统模型备受质疑。Sidler等[14]研究表明，膀胱颈周围的侵入性解剖操作破坏了膀胱的部分神经支配，并通过去神经支配破坏了膀胱颈与膀胱体之间的神经交互联系。即使是在除去结扎近端尿道，其余步骤同膀胱颈结扎法的假手术组中，也出现膀胱重量增加和膀胱功能障碍，这可能与去神经损伤有关，因此不能作为非神经源性pBOO的对照组动物模型。

最新的一些研究[6,15]已证实膀胱缺血和氧化应激介导pBOO中的膀胱壁重塑，此前机械刺激被认为是引起这一效应的主要原因[16]。研究人员就pBOO的发病机制得出了截然不同的结论，表明传统开放手术动物模型不够稳定，并且这些变化可能不容易被检测到。传统开放手术动物模型可能与临床上的pBOO患者具有不同的发病机制和病理生理过程。基于以上原因，有学者[14]在传统膀胱颈结扎法的基础上进行优化，发明了保留神经的尿道中段梗阻术，具体做法是在雌性小鼠插入24G血管导管作为导尿管，耻骨联合向尿道口施行约6 mm纵行皮肤切口，显微剪钝性分离带有尿道管支架的尿道，仔细解剖出尿道周围的神经血管束避免损伤，分离出在尿道与阴道之间的纵行平面，穿过5-0不可吸收丝线，外科结缝合结扎尿道，拔除尿道内导管造成梗阻，逐层缝合。结果显示与传统结扎膀胱颈法相比，保留神经的尿道中段梗阻术能更为准确控制梗阻程度，出现残余尿增加和膀胱纤维化的改变，但梗阻的膀胱不会显著扩大，更加贴合临床的膀胱梗阻性疾病的病理生理过程，也可避免腹部切口愈合过程中炎症以及膀胱与腹壁的粘连发生(这两方面会进一步引起膀胱功能障碍)。但即便如此，膀胱颈结扎依然是目前应用最广泛，也最被学术界认可的构建pBOO动物模型的方式。

2 经会阴途径结扎

为了避免经腹pBOO模型的这些缺点，Zhang等[17]报告了结扎会阴造成近端尿道梗阻模型: 麻醉大鼠后，暴露尿道并用直径1 mm的硬膜外导管通过尿道口插入膀胱。小心分离出尿道和阴道，并用4-0带线缝合针穿过会阴尿道周围。该手术不需要低位腹部切口，可避免损伤膀胱及其神经支配和尿道周围血管[18]。但该方法在缝合会阴尿道时只能盲目进针缝合，缝合深度无法定量操作，对术者技术要求较高。在此基础上，本课题组进一步创新实验思路，将大鼠尿道外口梗阻1/3面积，能得到与膀胱颈结扎类似的病理生理改变，最接近传统膀胱颈结扎法诱导pBOO病理生理过程中的最佳梗阻程度[19]。该动物模型能得到与经腹腔途径在组织学改变和膀胱充盈测压数据方面相近的结果。

另有学者[20]根据雄性大鼠的尿道解剖特点，从阴茎与阴囊连接部分离出阴茎海绵体，钝性分离出尿道球部后，适度结扎形成尿路梗阻。经会阴途径的pBOO动物模型构建能减少炎症反应，具有更简单的解剖结构，手术方式简单，更加接近临床上的pBOO病理生理过程。但作为一种方法论研究，该方法也存在一些局限性。Kim等[21]报道经会阴模型中pBOO致膀胱过度活动的尿动力学参数改变不如经腹模型明显，因此经会阴方法在模拟膀胱过度活动症时可能效果不佳。此外，可能损伤雄性鼠的勃起功能，因为经会阴进入膀胱不可避免造成海绵体损伤。

3 建立人工束缚环

pBOO定义是指膀胱颈或尿道由于多种病因引起尿液流出道阻力升高导致的尿液排出困难，出现尿潴留甚至损伤肾功能的疾病类型。据此定义，有学者[22]尝试在膀胱颈至尿道这一段解剖位置处将硅胶或金属环、气囊等不易吸收或变形的材料通过手术方法置入大鼠体内，人为建立束缚环，模拟膀胱颈流出梗阻或尿道狭窄的病理过程。同时利用异物产生的无菌性炎症反应，纤维瘢痕增生模型慢性梗阻的生理过程。此种动物模型的选择以雌性大鼠为主, 可避免膀胱过度充盈, 尿液反流进入精囊腺及附属腺体，引起脓毒血症或者膀胱内压力减少。

此种造模方法是在现代材料学的迅速发展下建立的，能够模拟pBOO患者的尿流动力学表现，但由于其存在异物排斥反应和组织相容性差的缺点，目前不能广泛用于pBOO动物模型构建。另外，目前也无标准的内径大小对照研究，其梗阻表现缺乏均一性，不能形成一致的梗阻程度。人工束缚环的建立过程与开放手术造模相比，仍存在较大手术创伤，手术的相关并发症可能影响动物模型构建的准确性。因此还需进一步寻找新型材料，使其模型更加标准化，也更加接近临床病理生理过程。

4 建立前列腺增生

近年研究[23]表明，较高水平的循环17β-雌二醇(E2)能增加老年男性发生下尿路症状风险，而男性中较低水平的循环睾酮(T)则会增加pBOO的严重程度。随着年龄的增加, 老年男性睾酮水平下降, 而E2的血清水平保持在相对恒定的水平，但游离T与E2比率的净效应是下降的, 雄激素和雌激素之间的比例不平衡可能会导致男性患者出现pBOO[24]。过度表达雌激素生物合成的限速酶——芳香化酶的雄性小鼠易发生pBOO，且伴随着膀胱尿路上皮和逼尿肌中的形态学变化以及过度增殖反应[25]。T联合使用E2可以模拟老年男性的激素环境，提高E2/T的比值，用于雄性小鼠可诱导出现前列腺相关的BOO症状[26,27]。

利用激素水平的变化构建新型pBOO动物模型的可行性在Nevile等[31]研究中得到了佐证。金属硫蛋白(MTs)是一种富含半胱氨酸的蛋白质，对金属有很强的亲和力，它参与了前列腺的细胞增殖、凋亡和肿瘤转化。研究人员[28]成功构建了前列腺特异性表达金属硫蛋白-1(MT1)的转基因鼠，但转基因鼠并未自发产生前列腺癌和前列腺上皮内瘤变等癌前病变，在所有E2治疗小鼠中观察到前列腺增生，68%的E2联合T治疗的小鼠中不伴有前列腺增生，但都发生了膀胱明显充盈伴尿潴留，症状类似于pBOO。因此，这种转基因动物模型，其对E2诱导的pBOO的易感性增加，可作为构建pBOO动物模型的一种选择方式。

5 尿道外口注射透明质酸

在兔尿道周围注射自体脂肪构建pBOO动物模型[29]，其原理是人为缩窄尿道外口面积，造成尿道狭窄，增加尿道阻力。理论上该方法可模拟尿频、膀胱重量增加等病理生理改变，但是存在感染的风险，以及后期自体脂肪组织吸收，梗阻症状自行好转的局限性。

近年来，随着新兴材料的不断出现，有学者将目光转移到利用膨胀剂构建pBOO动物模型。其中以透明质酸为代表，尿道外口均分为12点，在其皮下5、7和11点钟方向分别注射0.2 mL透明质酸钠，制作pBOO动物模型[30,31]。通过与传统膀胱颈结扎法比较，建模后4周采用尿流动力学检测模型建立后的稳定性，苏木精-伊红(HE)染色结果显示可以复制传统模型中的最大排尿压力、残余尿量、最大膀胱容量增加等典型pBOO尿流动力学表现，以及组织病理学中膀胱平滑肌肥大、胶原沉积和间质充血水肿典型的膀胱组织结构变化。可避免开放手术带来的感染，结扎程度不均一等并发症，操作更为简单，但由于透明质酸价格高昂，制作成本高，不适合用于大批次动物造模，因此，透明质酸尿道外口注射法可以作为一种候选的pBOO动物模型。

6 总结与展望

本文对pBOO动物模型的制作方法，包括传统制作方法、改良模型和新开发动物模型的优劣势进行了综述，目前尚无能完全模拟临床慢性下尿路梗阻的动物模型。其发病机制受到性别、年龄、性激素及饮食习惯等多种因素的影响，选择一种重复性好，能够再现大部分临床患者情况的动物模型对寻找新药靶点，延缓膀胱梗阻性疾病进展具有重要的科学和临床意义。

随着研究的进一步深入，仅仅出现下尿路梗阻表现已不能满足科学研究的需要，构建能与临床患者病理生理过程一致的动物模型，是目前泌尿外科医师和其他研究者需要关心和解决的问题。同时，如何将在动物模型上出现的相关信号通路和分子靶点转化到临床患者上，也是一个需要攻克的难题。值得注意的是，无论使用什么类型的模型，将动物研究的结果推广至临床应用时应格外谨慎。因此，仍需要在现有研究基础上，对pBOO动物模型开展进一步的探索和思考，以期能构建更为符合临床实际的动物模型，为寻找治疗膀胱梗阻性疾病的合理有效的分子药物靶点打下基础。