湿地环境可培养粘细菌多样性研究

张鲜姣, 吕颖颖, 朱红惠

广东省微生物研究所, 省部共建华南应用微生物国家重点实验室; 广东省微生物菌种保藏与应用重点实验室; 广东省微生物应用新技术公共实验室, 广州 510070

粘细菌是一类能够滑动的、具有多细胞行为的革兰氏阴性菌，可形成形态各异、颜色多样的子实体结构[1]。因其能产生丰富多样的活性次级代谢产物，被公认为是继放线菌、芽孢菌之后的又一药源微生物新类群[2]，具有广阔的应用前景。但由于粘细菌难以分离纯化，使其可用于活性物质筛选的种质资源远远滞后于其他细菌。从1892年[3]发现第1株粘细菌至今的百余年时间里，分离获得可培养的粘细菌共3个亚目、11个科、28个属、60多个种(http://www.bacterio.net)。

粘细菌作为微生物中重要的捕食者和大分子物质降解者，广泛分布于从陆地到海洋的各种环境中，并以其特有的形式参与到地球生物圈的物质循环中。多年来，已有研究对全球各类环境中粘细菌的分布进行了广泛的调查和研究[4]。近年来，研究人员从土壤环境中分离到较多的粘细菌新种[5～9]，同时又从海洋环境中分离出多株耐盐或嗜盐粘细菌[6～14]，但有关从淡水环境中分离粘细菌的研究报道较少[15～20]。如李越中教授团队从程海湖底泥分离到113株粘细菌[16]；何丽明等[19]从衡水湖样品中获得了4个属的24株粘细菌；研究人员在对鄱阳湖底泥样品进行高通量测序时，发现存在大量的粘细菌序列(2.5%)[21]。

湿地是介于陆地生态系统和水生生态系统之间的过渡地带，被誉为“地球之肾”，具有独特的功能和特性，是自然界最具生物多样性的生态景观，也是人类最重要的生存环境之一。微生物是湿地物质循环和能量循环的参与者，在维持湿地生态系统平衡中发挥着重要作用，是不可缺少的一部分[22,23]。

广东省位于我国大陆南端，分布着多条河流、湖泊且拥有绵长的海岸线，孕育了丰富的湿地资源，其中包括近海与海岸湿地、河流湿地、湖泊湿地、沼泽湿地和人工湿地等类型[24]。本文选取近海岸湿地(南沙湿地)、湖泊湿地(肇庆星湖湿地)和人工湿地(海珠湿地)为研究对象，分析不同类型的湿地环境中粘细菌的多样性，并获得纯培养物，以期为其后续开发利用及其活性代谢产物的研究奠定物质基础，并为湿地环境粘细菌资源的挖掘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1样品采集 本研究所用样品于2013年10月和2014年9月采自广东海珠湿地、南沙湿地及肇庆星湖湿地。采用自制的柱状采样器随机采集湿地底泥样品84份，采样深度为50～150 cm；样品采集后分装于无菌采样袋中；室温风干7～10 d后过2 mm筛子，随后装于无菌袋中，置于4℃保存。

1.1.2培养基 水琼脂培养基(WCX)、CNST琼脂培养基、VY/2琼脂培养基和CAS培养基配方参考Rechenbach等[1]的研究。

1.2 粘细菌分离、纯化

1.2.1样品预处理： 称取10.0 g 风干样品于灭菌培养皿中，加入含有放线菌酮及制霉菌素(放线菌酮:制霉菌素为1∶1，终浓度均为200 μg/mL)的无菌水中，室温浸泡过夜。

1.2.2粘细菌分离： 在超净工作台中，将浸泡好的土样接种到用助长菌(GIMCC1.611)[25]及大肠杆菌交叉划线的水琼脂培养基和CNST培养基的滤纸上。置于30℃培养箱中培养，第5天开始观察子实体的形成情况，随后每间隔3～5 d观察1次，连续观察1个月以上。

1.2.3粘细菌纯化与保藏： 体式镜下挑取子实体转接于VY/2琼脂培养基上。待长出子实体或扩展的菌膜后，挑取子实体或菌膜边缘继续纯化，直至无杂菌生长。而后将菌株挑取到CAS液体培养基中，30℃、150 r/min，振荡培养10 h。若培养基变浑浊，则说明菌株不纯；若培养基澄清，则表明菌株已纯。将纯菌株接种于VY/2斜面培养基，待长出子实体及菌膜后，置于4℃保存；将纯菌株加入30%灭菌的甘油中，置于-80℃长期保存；同时，将纯菌株加入牛奶保护剂中进行冻干保藏。

1.3 菌株鉴定

1.3.1形态鉴定 根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[1,26]中粘细菌的分类标准，记录粘细菌的子实体颜色及形态、营养细胞和粘孢子的形态大小以及菌落形态特征等，并据此将粘细菌大致归类到属。

1.3.2分子鉴定 采用十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取菌株DNA，以通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)PCR扩增16S rRNA基因。PCR反应体系(25 μL)：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，27F/1492R(10 μmol) 各0.5 μL ， 模板 DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 30 s，共35个循环；72℃ 10 min。将PCR产物经电泳检测后交至上海美吉生物医药科技有限公司测序。采用在线分析工具Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net)对菌株16S rRNA基因序列进行相似性分析，确定菌株的种属地位。取相似性较高的模式菌株16S rRNA基因作为参比，利用ClustalX做多序列比对分析，再用MEGA软件以邻位法构建系统发育树，进行系统发育分析，完成可培养粘细菌的多样性分析。

2 结果与分析

2.1 湿地环境粘细菌的分离及鉴定

从广东海珠湿地、南沙湿地及肇庆星湖湿地采集底泥样品共84份；采用助长菌诱导法及滤纸诱导法进行分离纯化，共获得粘细菌67株。根据子实体和菌落的形态、颜色等特征，并结合16S rRNA基因序列分析结果，将这些菌株初步鉴定为7个属(图1，彩图见图版三)，分别是粘球菌属(Myxococcus)32株、珊瑚球菌属(Corallococcus)15株、孢囊杆菌属(Cystobacter)2株、多囊菌属(Polyangium)5株、原囊菌属(Archangium)7株、匣状球菌属(Pyxidicoccus)5株、波管状菌属(Hyalangium)1株。

从分离培养基上观察到的粘细菌子实体形态多样、结构复杂(图2,彩图见图版四)。有的子实体单生，如粘球菌属菌株子实体多以单生为主(图2 A、H)；有的聚集成链状或者成团，如原囊菌属及珊瑚球菌属(图2 E、I)；有的不形成子实体，而呈辐射状向外延伸，如多囊菌属(图2D)。不同种属子实体的颜色也存在较大的差异，主要有黄色、橙色、白色、粉红色、棕色、褐色和黑色。

图1 湿地环境中分离到粘细菌分布情况Fig.1 The distribution of myxobacteria in wetland. (彩图见图版三)

从WXC培养基及CNST分离培养基中共挑取到271株粘细菌，经多次挑取边缘子实体或菌膜进行纯化、去重复后，共得到67株纯培养物。从VY/2琼脂培养基上观察，菌落形态及颜色较为多样(图3,彩图见图版四)。有的向外扩张成大的菌落，如粘球菌属及原囊菌属菌株(图3B、C)；有的形成细密的子实体，多数为珊瑚球菌属(图3E)；有的刻蚀琼脂，如多囊菌属(图3D)；而颜色有黄色、橙色、黄褐色以及褐色。在长期反复的转接过程中，部分粘细菌子实体退化。如大部分原囊菌属(Archangium)以及孢囊杆菌属(Cystobacter)的菌株不形成子实体；而孢囊菌属粘细菌随着转接次数增多会越长越弱，甚至死亡。

图2 部分粘细菌子实体图Fig.2 Morphological characteristics of fruiting body of some myxobacteria strains. A：x18j31，粘球菌；B：23j22，粘球菌；C：x19x31，孢囊杆菌；D：60ax32，多囊菌；E：x3x2，原囊菌；F：y53x22，匣状球菌；G：46ax41，波管状菌；H：20j1，粘球菌；I：51ax31，珊瑚球菌。 (彩图见图版四)

图3 部分粘细菌菌落图Fig.3 Morphological characteristics of swarm of some myxobacteria strains. A：x18x21，匣状球菌；B：x12x1，粘球菌；C：x3x2，原囊菌；D：60ax32，多囊菌；E：32j1，珊瑚球菌；F：x19x31，孢囊杆菌。 (彩图见图版四)

2.2 湿地环境可培养粘细菌系统发育分析

选取27株已测序菌株及相似性最高的模式菌株构建系统进化树(图4)。从发育树上可发现，27株粘细菌大体可分为3个分支。第1分支属于粘球菌科(Myxococcaceae)，第2分支属于孢囊杆菌科(Cystobacteraceae)，第3分支属于多囊菌科(Polyangiaceae)。第1分支中包含3个属，分别是粘球菌属、珊瑚球菌属和匣状球菌属，本研究分离到的大部分粘细菌属于这一分支。其中粘球菌属(Myxococcus)与匣状球菌属(Pyxidicoccus)菌株聚类在一起，区分不开。珊瑚球菌属(Corallococcus)的4株菌(8x1、15ax1、x9x2、69ax1)与模式菌株弱小珊瑚球菌(CorallococcusexiguusDSM14696)及珊瑚状珊瑚球菌(CorallococcuscoralloidesDSM2259)聚集成独立一支。第2分支为孢囊杆菌科，包括原囊菌属、孢囊杆菌属和波管状菌属。菌株46ax41与HyalangiumminutumDSM14724聚类在一起；菌株x2j32、15j1、x3x2与原囊菌属、孢囊杆菌属和波管状菌属聚为一支。第3分支为多囊菌属，菌株y55x31、6x11、15j22与多囊菌属模式菌PolyangiumfumosumPl fu5、PolyangiumsorediatumPl s21聚成一类。从16S rDNA进化树上看，各菌株分类地位较为明确。

2.3 不同类型湿地环境中粘细菌分布情况

本研究对海珠湿地、南沙湿地、肇庆星湖湿地的粘细菌分布进行了统计(表1)。从海珠湿地28份样品中分离到5个属的19株粘细菌；从南沙湿地23份样品中分离到6个属的25株粘细菌，其中分离到1个海洋粘细菌特有的属——波管状菌属；从肇庆星湖湿地33份样品中分离到5个属的23株粘细菌。

由表1可知，在3个湿地中，出菌率最高的是海珠湿地(50.0%)，其次为星湖湿地(45.4%)，最低的为南沙湿地(43.5%)。从分离的种群来看，粘球菌属(Myxococcus)分离到的数量最多，出菌率明显高于其他种属；其次为珊瑚球菌属(Corallococcus)。这可能是因为本研究采用的分离方法对粘球菌属和珊瑚球菌属较为有效，且这2种菌也较为常见。

3 讨论

本研究对广东海珠湿地、南沙湿地及肇庆星湖湿地的84份底泥样品进行了粘细菌的分离纯化，从中共获得2个亚目、3个科、7个属的67株粘细菌。初步鉴定为粘球菌属32株、珊瑚球菌属15株、孢囊杆菌属2株、多囊菌属5株、原囊菌属7株、匣状球菌属5株、波管状菌属1株。本实验分离到的粘细菌菌株约93%属于孢囊杆菌亚目(Cystobacterineae)，而多囊菌亚目(Sorangiineae)仅分离到多囊菌属的菌株，未曾分离到侏囊菌亚目(Nannocystineae)的粘细菌菌株。主要原因是多囊菌亚目和侏囊菌亚目的粘细菌多数处于未培养状态，并且侏囊菌亚目粘细菌多为来源于海洋环境的嗜盐或耐盐粘细菌。查阅近几年粘细菌的相关文献，发现大部分粘细菌新种属来自于多囊菌亚目和侏囊菌亚目，可见自然环境中存在着大量的粘细菌新类群，并有待进一步发掘。

图4 湿地27株粘细菌及模式菌株16S rDNA基因NJ进化树Fig.4 Phylogenetic tree of 27 myxobacteria strains and reference stains based on 16S rDNA genes.

取样地点样品数(份)出菌样品数(份)样品出菌率(%)分离到的各属粘细菌(株)粘球菌属珊瑚球菌属孢囊杆菌属多囊菌属原囊菌属匣状球菌属波管状菌属总计海珠281450．0660133019南沙231043．51642110125星湖331545．41050332023共计843946．432152575167

本研究从不同类型湿地环境中获得了粘球菌属32株、珊瑚球菌属15株，两者占粘细菌总数的58.2%。究其原因有：①粘球菌属、珊瑚球菌属的粘细菌生长速度较快，3～5 d即可形成子实体，所以受其他杂菌污染较少，易于纯化。②粘球菌子实体颜色鲜艳，以橙色、黄色居多，且子实体单生、体型大，相对而言易于挑取；而珊瑚球菌属子实体生长易连成一片，子实体为橙色且小，呈珊瑚状的分支，无粘液包裹，易于挑取。③本研究采用的分离纯化方法可能易于这两者的分离。粘细菌分离主要依靠在体式镜下挑取子实体，而这两者的子实体无粘液包裹，挑取时夹带的杂菌少，基本一经转接就可以纯化，相对其他种属的粘细菌而言较为简单，耗时少。④这2个属的粘细菌适应性强，在各类环境中普遍存在[4]。

粘细菌曾被认为是典型的土壤微生物，但经研究证实，淡水环境也是粘细菌的重要生境[27]。本研究从不同类型湿地环境中分离到了7个属的67株粘细菌，其中还纯化到海洋环境中特有的波管状菌属(Hyalangium)1株，并且分离到的5株多囊菌属菌株与模式菌株PolyangiumfumosumPl fu5最大相似性均小于98.6%，为潜在新物种。由此可见，在湿地环境中存在着丰度较高的粘细菌类群，并且其中一些类群还是尚未获得纯培养物的稀有粘细菌物种资源。

本研究表明，湿地底泥环境中蕴含着丰富的粘细菌资源，但由于受到分离纯化方法的限制，仍有大量的粘细菌类群未能得到纯培养物，所以，优化粘细菌分离纯化方法以获得更多的粘细菌资源显得尤为重要。另外，对于已分离到的粘细菌应进行培养条件的优化，并对其产生的活性代谢产物进行深入研究，以完善对湿地环境粘细菌资源及其代谢产物的开发利用。与此同时，湖泊底泥样品有机质丰富，所处环境氧含量较低，是分离厌氧粘细菌的重要来源之一，后续可对湿地环境中可培养的厌氧粘细菌进行探索分离。

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