污水中抗生素抗性菌及抗性基因的去除技术

陈蕾，George (Zhi) ZHOU

1. 南京林业大学土木工程学院，江苏 南京 210037；2. 美国普渡大学土木工程学院，美国 印第安纳州 47906

抗生素自被发现以来被广泛应用于人类医疗及畜禽与水产养殖业，给人类带来了诸多益处。然而，因滥用抗生素导致的抗性细菌（ARB）及抗性基因（ARG）污染正威胁着人类健康与生态安全，已引起全球的高度关注。据估算，每年因抗生素抗性菌引起的死亡人数在美国至少达23000人，欧洲将近25000人，而欠发达国家则更多（Vikesland et al.，2017）。细菌通过自身突变或抗性基因的水平转移等途径获得抗性基因，进而通过改变药物作用靶位、主动外排药物、产生抗菌药物钝化或灭活酶、改变孔蛋白阻止抗生素渗透或改变药物代谢途径等机制对抗生素产生抗性（Bengtsson-Palme et al.，2018）。抗性菌中携带抗性基因的质粒、转座子、整合子等载体又能通过基因的转化、转导、接合和转座等方式在环境中进行传播扩散，即使抗性菌死亡，其携带抗性基因的裸露DNA也会在环境中长期存在（Davies，1994）。虽然细菌在自然条件下就能产生抗生素抗性基因，但是持久性存在的低浓度抗生素对细菌产生选择压力，使被抗生素污染的环境介质中抗性菌及抗性基因的水平远远高于环境背景值（Bengtsson-Palme et al.，2018）。目前，中国及其他国家的养殖场废水、医疗废水、污水处理厂各级出水、地表水、底泥、土壤及大气中均检测到了抗生素抗性菌和抗性基因的污染（Storteboom et al.，2010；Guo et al.，2014；Czekalski et al.，2015；Li et al.，2015；沈怡雯等，2015；Bougnom et al.，2017）。城镇污水处理系统汇集了居民生活、工业生产、农业生产、医疗卫生等各方面的废水，将多种类型的抗性基因混合、转移和传播，使抗性基因在污水和污泥中广泛分布，最后通过出水及污泥排放到受纳环境中，造成环境污染（Korzeniewska et al.，2013；Lee et al.，2017）。

城镇污水是抗性菌和抗性基因重要的“汇”和“源”，因此污水中抗性菌和抗性基因的高效去除是控制环境中抗性基因污染与传播的重要措施。本文综述了近几年生物处理工艺、消毒工艺及高级氧化处理技术等去除污水中抗性菌及抗性基因的研究进展，并对未来的研究方向提出建议，为完善污水厂现有的处理工艺以及研发高效的抗性菌及抗性基因的去除技术提供一定的思路。

1 生物处理法对ARB和ARG的去除

1.1 活性污泥及相关工艺

活性污泥及相关工艺是城市污水厂最常用的处理系统。研究表明，活性污泥工艺对进水中的抗性菌和抗性基因有显著的削减作用。Zhang et al.（2009a）研究了中国和美国五大城市的活性污泥工艺对四环素抗性基因的去除，发现出水中的四环素抗性基因tetC和tetA均比进水降低了3个数量级。Börjesson et al.（2010）研究发现，传统活性污泥工艺可使污水中的四环素抗性基因 tetA浓度减少0.4～1.5 log单位，tetB减少0.5～1.6 log单位。Gao et al.（2012）也发现经活性污泥工艺处理后出水中的四环素和磺胺类抗生素的抗性菌及抗性基因浓度显著降低。但是，这些减少的抗性菌和抗性基因主要被污泥吸附，并未得到真正地去除，会随着污泥的再利用而进入土壤环境，威胁人类健康（Börjesson et al.，2009）。因此，活性污泥工艺中污泥的后续处理非常重要，其中高温厌氧条件下的污泥消化对抗性菌和抗性基因具有明显的去除作用（Diehl et al.，2010）。

活性污泥相关工艺，如缺氧/好氧工艺（A/O）、厌氧/缺氧/好氧工艺（A2/O）及序批式活性污泥反应器（SBR）等，因其增加了污水与污泥的有效接触而取得了较好的处理效果，被广泛应用于城市污水处理。但是污水停留时间的延长有利于细菌的变异与增殖，加速抗性基因的水平转移，造成出水中抗性基因的种类显著增加。如Zhang et al.（2009b）研究发现A/O处理工艺的出水中，不动杆菌对多种抗生素的抗性比进水增加 10%左右。此外在 A2/O工艺中也出现大肠杆菌和肠球菌对抗生素的抗性增强的现象（Łuczkiewicz et al.，2010）。Fan et al.（2011）发现序批式活性污泥反应器（SBR）中微量的红霉素对细菌产生选择压力，促进抗性基因的形成与传播，出水中检测到了进水中未检测到的红霉素抗性基因。

可见，虽然活性污泥及相关工艺对污水中抗性菌和抗性基因有一定的去除效果，但是去除率不高，且生化池中高的抗生素浓度和高的微生物量加快了抗性基因的传播，导致二级出水中依然含有较高浓度的抗性菌和抗性基因。此外，富集了抗性菌和抗性基因的污泥可能成为二次污染源，也需要进一步处理。

1.2 膜生物处理工艺

膜生物处理工艺在城市污水的处理中也有广泛的应用。Börjesson et al.（2010）对比了活性污泥工艺和滴滤池对四环素抗性基因的去除，发现后者的处理效果更好。由于膜生物处理工艺中的微生物附着在载体上生长，残留在出水中的生物质含量较少，因此出水中的抗性菌和抗性基因比活性污泥工艺更低。Novo et al.（2010）则对比了淹没式的曝气生物滤池和滴滤池对抗性菌的去除，发现曝气生物滤池能使抗性菌的数量降低 2个数量级，而滴滤池的去除率低于 50%，并指出生物处理工艺、水力停留时间及进水水量等是影响膜生物处理去除抗性菌效果的重要因素。Munir et al.（2011）对比研究了膜生物反应器（MBR）、活性污泥工艺、氧化沟工艺、旋转式生物接触反应器等对四环素类和磺胺类的抗性菌和抗性基因的去除效果，发现MBR对抗性菌和抗性基因的去除率达到2.57～7.06 log单位，明显优于其他工艺（2.37～4.56 log单位），并认为不同处理工艺之间的差异是由环境中的多重选择压力造成的。Sui et al.（2018）构建了序批式膜生物反应器（SMBR）来去除养猪废水中的抗性基因，发现当固体停留时间较长时（30 d），膜的分离作用明显，ARG的去除率达1.18个log单位；在固体停留时间较短时（12 d），生物处理占主导作用，ARG的去除率最大，为2.91个log单位。Zhu et al.（2018）研究了 MBR反应器中膜污垢在抗性基因去除过程中的作用，发现膜污垢中的可溶性微生物产物（SMP）及其胞外多聚物（EPS）的含量与抗性基因的丰度显著相关，说明膜污垢在MBR反应器去除抗性基因的过程中发挥着重要的作用。在膜生物处理工艺中，水中的抗性菌和抗性基因是通过富集到生物膜中而得以去除，因此跟活性污泥类似，膜生物处理工艺如滴滤池的生物膜中同样富集了大量的抗性菌和抗性基因，若后续没有得到有效处理，将会成为环境中抗性菌和抗性基因的二次污染源（Petrovich et al.，2018）。

通常膜生物处理工艺对水中抗性菌和抗性基因的去除效果普遍高于活性污泥工艺；此外污水停留时间短，污泥量少，造成二次污染的风险也比活性污泥工艺低。

1.3 人工湿地处理系统

人工湿地由于其工艺简单、成本低及高效等优点而被广泛应用于人口较少的城镇或农村生活污水的处理。人工湿地不仅对污水中的有机物、氮磷、抗生素、药物等均具有较好的处理效果，对抗性基因也具有一定的去除效果（郑加玉，2013；Sharma et al.，2016）。Chen et al.（2013）发现人工湿地能有效地去除城市污水中四环素和磺胺类的抗性基因，在厌氧生物过滤后加设人工湿地处理系统可以使农村生活污水中四环素和磺胺类的抗性基因的去除量提高2个数量级。Liu et al.（2013，2014）研究发现，自由表面流人工湿地出水中的四环素和磺胺类的抗性基因水平明显低于进水，而垂直潜流人工湿地及水平潜流人工湿地对抗性基因的去除效果不明显，因此提出表层水中的氧化作用是抗性基因被去除的主要机理。然而，Huang et al.（2015）研究则表明，垂直上升流的人工湿地对养猪废水中的四环素抗性基因的去除率达45%～99%。此外，垂直流人工湿地的填料对抗性基因的去除也有显著的影响。Liu et al.（2013）研究指出，以沸石作为填料的垂直流人工湿地对抗性基因的去除效果比以火山岩作为填料的垂直流人工湿地好，更小的填料粒径有利于抗性基因的去除，因此填料对抗性基因的吸附也是其去除抗性基因的机制之一。然而，杨芳等（2013）在研究不同类型的人工湿地去除抗性大肠杆菌及抗性基因中发现水中的抗性基因转移到了基质生物膜上，随着生物膜的脱落，出水中的抗性基因的含量依然较高。He et al.（2018）研究比较了不同类型的人工湿地对污水厂二级出水中抗性菌和抗性基因的去除作用，发现所有类型的人工湿地出水中抗性菌的数量均显著增加，原因是细菌出现再生长；垂直潜流人工湿地和其中的一种表面流人工湿地对抗性基因有显著的去除作用，去除率分别为14%～95%以及57%～100%，而另外一种表面流人工湿地出水中抗性基因的浓度反而增加，其原因可能是污水中低浓度的抗生素、重金属等对抗性菌产生了选择压力，促进了抗性基因的传播，此外人工湿地适宜的条件有利于微生物的再生长。

可见，人工湿地处理系统对抗性菌和抗性基因的去除效果与湿地的类型、植物种类、水力负荷及填料种类等有关，在实际应用中，需针对污水的性质设计相应的人工湿地处理系统。

2 消毒工艺对ARB和ARG的去除

2.1 氯消毒工艺

随着城市污水厂出水要求的提高，二级出水之后加设消毒环节越来越普遍。氯消毒是最普遍的水和废水的消毒工艺。氯消毒产生的次氯酸具有强氧化性，能迅速氧化细胞成分，包括核碱基的嘌呤和嘧啶基团等，其中与游离性的碱基反应性很强，但因氢键的原因与双链DNA的反应活性较弱（Dodd，2012）。

采用氯消毒去除抗性基因的过程中，次氯酸首先氧化细胞壁，然后进入细胞内部与 DNA反应，因此只有较高的加氯量才能保证次氯酸进入到细胞内与 DNA反应，而污水厂常规氯消毒剂量通常难以有效去除抗性基因（Munir et al.，2011；Gao et al.，2012）。Huang et al.（2011）采用 10 mg·L-1（Cl2）的次氯酸钠对二沉池出水进行消毒，接触时间10 min，发现青霉素、氨苄西林、四环素和利福平的抗性菌减少了4个数量级，但是对氯霉素抗性菌无明显去除效果。Yuan et al.（2015）研究了氯消毒对污水中9种抗生素抗性菌和抗性基因的去除作用，加氯量范围为 15～300 mg·min·L-1，发现除磺胺嘧啶和红霉素的抗性菌之外的其他抗性菌都能被15 mg·min·L-1的氯完全灭活，而磺胺嘧啶和红霉素的抗性菌需要施加大于60 mg·min·L-1的氯才能被完全灭活；最高剂量的氯消毒对红霉素抗性基因和四环素抗性基因的去除率仅为60%和20%。Zhang et al.（2015）研究表明，氯消毒对抗性基因的去除效果跟加氯剂量和接触时间密切相关，加氯量越大，接触时间越长，抗性基因的去除率越高；施加 30 mg·min·L-1的氯可去除1.3～1.49 log单位的磺胺类和四环素抗性基因；溶液中的铵态氮则对抗性基因的去除产生明显的抑制作用。然而，Huang et al.（2011）研究则指出，氯消毒虽然可以有效去除抗性菌，但是残留的微生物群落发生了很大的变化，其中抗氯霉素、氨苄西林和青霉素的菌比例增加。Shi et al.（2013）研究也发现，经氯消毒后的饮用水中四环素、红霉素等数种抗性基因的比例增加。可见，氯消毒很可能对微生物产生选择压力，从而加速了抗性基因的传播，增加了出水的环境风险。

2.2 紫外消毒工艺

紫外消毒（UV）的原理是细菌的RNA和DNA结构被所吸收的紫外线光能破坏。采用UV去除抗性基因的过程中，紫外光直接破坏细胞内携带抗性基因的DNA片段，而对细胞其他组分不产生影响（Guo et al.，2015）。Auerbach et al.（2007）和 Lee et al.（2017）研究均表明，污水处理厂的常规紫外消毒剂量对四环素类、磺胺类、红霉素类等多种抗性基因均无明显的去除效果。Mckinney et al.（2009）发现紫外消毒可以去除1个数量级的甲氧西林抗性基因，但是对万可霉素抗性基因无明显去除效果。通常紫外辐射的强度越大，抗性基因的去除效率也越高（Zhang et al.，2015）。Mckinney et al.（2012）采用紫外消毒处理mecA、vanA、tetA和ampC 4种抗性基因，发现 10～20 mJ·cm-2的紫外剂量能灭活4～5个数量级的抗性菌，而高达 200～400 mJ·cm-2的紫外剂量仅能去除3～4个数量级的抗性基因；且革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对紫外消毒有更强的耐受性。Chang et al.（2017）采用紫外消毒工艺对含有氨苄西林和四环素抗性基因的质粒进行降解研究，发现转导效率每降低一个log单位，紫外辐照的剂量需增加20～25 mJ·cm-2。可见，采用紫外消毒工艺有效去除抗性基因需要很高的紫外辐照剂量，远远超出常规的紫外消毒剂量。

2.3 臭氧消毒工艺

臭氧消毒的原理是利用臭氧及臭氧分解产生的羟基自由基（·OH）的强氧化性破坏细胞的结构。臭氧与细胞壁和细胞膜的肽聚糖、蛋白质及脂类具有很强的反应性，所以除非施加较高的浓度，通常臭氧难以渗透到细胞内与DNA反应（Dodd，2012）。与次氯酸相似，臭氧与游离性的碱基反应活性较高，但是与双链DNA的反应活性则较低（Somensi et al.，2015）。

臭氧及其分解产生的羟基自由基首先氧化破坏细胞壁组分，然后渗入细胞内部，氧化降解携带抗性基因的DNA片段，因此有效去除抗性基因所需的臭氧剂量比常规消毒剂量高（Oh et al.，2016）。Öncü et al.（2011）发现臭氧能有效去除含抗性基因的质粒，0.9 mg·L-1的臭氧就能使质粒的双螺旋结构解开，当臭氧剂量为4.2 mg·L-1时，质粒DNA浓度最低。Oh et al.（2016）研究发现，臭氧消毒可使含抗性基因的质粒的转导性能降低1个数量级，同时加入过氧化氢或过硫酸盐可以显著提高去除效率。Czekalaki et al.（2016）从实验室和工程应用角度分别研究了臭氧消毒对污水中磺胺类sul1抗性菌和抗性基因的去除作用，实验室的研究指出预絮凝和高的臭氧浓度（O3与DOC浓度比大于 0.55）均有利于抗性菌和胞内抗性基因的有效去除，而污水厂的工程实践研究则表明虽然臭氧消毒能杀灭抗性菌，但是部分灭活的抗性菌之后会复活，且臭氧消毒对胞内抗性基因没有显著的去除效果。

2.4 纳米颗粒杀菌技术

采用纳米颗粒去除抗性菌和抗性基因的研究主要集中在医药研究领域。金属氧化物纳米颗粒如纳米氧化银、纳米氧化铜等均具有一定的杀菌作用，其原理主要是具有高比表面积的纳米粒子对细菌细胞内的酶、蛋白质等生物分子产生强吸附作用，破坏生物大分子的生理功能从而达到杀菌的效果（Huang et al.，2014）。有研究表明，纳米氧化铁可以灭活抗性生物膜（Taylor et al.，2012）。纳米金颗粒与万古霉素联用可以杀灭万古霉素抗性菌（Mohammed et al.，2011）。然而，纳米颗粒也会对细菌产生选择压力而促进抗性基因的传播，如纳米铝颗粒可以使含多种抗生素抗性基因的质粒的水平转移效率提高200倍（Qiu et al.，2012）。因此，在水处理中采用纳米颗粒杀菌技术存在增加抗性基因传播的风险。

2.5 不同消毒工艺间的比较

不少研究者对比了常见的几种消毒工艺对抗性菌和抗性基因的去除效果。在对抗性菌的去除方面，Macauley et al.（2006）比较了氯消毒、紫外消毒和臭氧消毒对养猪废水中的金霉素、林可霉素、磺胺甲嘧啶和四环素的抗性细菌的去除效果，发现UV消毒＞臭氧消毒＞氯消毒；然而 Zheng et al.（2017）研究则发现，臭氧消毒在杀灭抗性菌方面是最高效的。在对抗性基因的去除方面，Zhuang et al.（2015）和Zhang et al.（2015）对比了常见的几种消毒工艺对磺胺类和四环素类抗性基因的去除效果，发现单工艺中氯消毒是去除抗性基因最高效的手段，且经济成本最低；当紫外和氯联合消毒时则能进一步提高抗性基因的去除率。此外，在影响抗性基因的水平转移风险方面，Guo et al.（2015）对比研究了紫外消毒和氯消毒对抗性基因的水平转移的影响，发现低剂量的紫外消毒（8 mJ·cm-2）直接破坏DNA，降低了细菌的数量，而没有改变细菌细胞的渗透性，因此对抗性基因的水平转导没有影响，高剂量的紫外消毒（＞10 mJ·cm-2）则能提高抗性基因的水平转移的风险；而即使低剂量的氯消毒（40 mg·min·L-1）则能使抗性基因的转移几率提高2～5倍，且加氯浓度越高，转移几率越大；此外氯消毒过程中产生的氯胺会增强细胞的渗透性，进一步提高抗性基因转移的风险。

因此，不同的消毒方式对抗性菌和抗性基因的去除效果与抗性基因的种类、消毒剂量、水质等密切相关，实际应用中需要综合考虑抗性基因的去除效果、处理成本及抗性基因的转移风险等因素。从抗性基因的去除和转移风险来看，紫外消毒优于氯消毒和臭氧消毒。

3 高级氧化技术对ARB和ARG的去除

近年来有不少研究者开始将高级氧化技术应用于污水中抗性细菌和抗性基因的去除，且获得了非常高的去除效率。高级氧化技术对抗性基因的去除主要归因于体系中产生的羟基自由基对抗性基因的氧化破坏（Pham et al.，2014）。Karaolia et al.（2014）研究发现，太阳光Fenton体系可以使抗磺胺磺胺甲恶唑和克拉霉素的肠球菌减少5 log单位。Fiorentino et al.（2015）对比了太阳光/H2O2、太阳光/TiO2、太阳光/H2O2/TiO2和太阳光Fenton对多种抗生素抗性菌的灭活作用，发现太阳光/TiO2和太阳光Fenton的灭活效果最佳。Zhang et al.（2016）采用Fenton和UV/H2O2技术处理污水厂的二级出水，发现两者均对污水中磺胺类和四环素类抗性基因有显著的去除作用，在最佳的配比条件下，去除效果分别达2.26～3.35 log单位和1.55～2.32 log单位。Yoon et al.（2017）研究发现UV/H2O2对胞外抗性基因（质粒）有很好的去除效果，但是对胞内抗性基因的去除效果一般。Guo et al.（2017）发现UV/TiO2对mecA和ampC两种抗生素的抗性菌和胞内及胞外抗性基因均有显著的去除作用，其基因的长度越长，对UV的耐性也越强；H2O2的加入会进一步促进抗性基因的降解，其原因是增加了羟基自由基的生成量。虽然与生物处理法和消毒工艺相比，高级氧化技术具有更高的去除效率和较低的基因转移风险，但是处理成本相对较高，TiO2光催化工艺中TiO2的固定以及Fenton体系中污泥的产生等问题限制了其大范围的工程应用。

此外，还有研究者提出微滤/超滤和混凝处理有助于污水中抗性基因的去除，将其与污水厂原有的工艺相结合有望降低出水中的抗性基因水平（Breazeal et al.，2013；Li et al.，2017）。

4 结论与展望

城镇污水中抗生素抗性菌和抗性基因的去除效率是控制环境中抗性基因污染与传播的关键因素。生物处理是常规城市污水处理流程中抗性菌和抗性基因去除的主要环节，而污泥的后续处理是避免二次污染的重要措施。消毒工艺对抗生素抗性基因的去除具有选择性，且通常需要很高的消毒剂量才能达到有效的去除。生物处理和消毒工艺都会加速抗性基因的传播，而高级氧化处理技术不仅去除效果好，且能有效控制抗性基因的传播，因此利用高级氧化技术去除抗性菌和抗性基因将是今后发展与应用的重要方向。然而，将以上处理手段用于工程实践时仍存在诸多问题，建议今后从以下几方面开展研究：

（1）研究生物处理工艺中污泥的高效处置方法，尽量避免抗性基因的二次污染；同时深入研究水力、水质参数抗性基因水平转移的影响与机制，通过调整运行参数尽量减少常规生物处理系统中抗性基因的传播。

（2）深入研究消毒工艺中抗性基因种类、水质参数、消毒剂量等对抗性基因水平转移的影响，开发低剂量的组合消毒工艺，在高效去除抗性基因的同时尽量减少抗性基因的传播。

（3）研究 TiO2的固定化工艺，提高 TiO2的利用效率；同时研发电化学高级氧化、硫酸根自由基氧化等更高效、经济的对抗性菌及抗性基因的控制技术。

（4）由于单工艺通常使用的剂量较大、成本较高、去除效果不理想且增加了抗性基因传播的风险，今后应针对多工艺的联合处理技术开展深入的研究。