E-Cad、EGFR和FOXA1在三阴性乳腺癌中表达的临床意义

张言敏，孙辉，李玉军

（1.青岛大学医学部 病理系，山东 青岛 266071；2.山东省潍坊市人民医院肿 瘤外科，山东 潍坊 261000；3.青岛大学附属医院 病理科，山东 青岛 266000）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）特指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）表达均为阴性的乳腺癌，其发病率占所有乳腺癌的10%～20%[1]。与非三阴性乳腺癌（non-tri-negative breast cancer， NTNBC）比较，TNBC具有侵袭性强、预后差、易复发及内分泌治疗不敏感等特点，已成为医疗领域广泛研究的对象[2]。临床研究发现，乳腺癌的10年存活率平均为60%，一期乳腺癌治疗后的存活率达80%，零期乳腺癌治疗后的存活率更接近100%，因此乳腺癌的早期诊断并及时治疗非常重要[3]。由于TNBC的治疗相比于NTNBC更为棘手，所以早期诊断出乳腺癌的同时并发现TNBC的意义更为重要。

研究发现，E-钙黏蛋白（E-cadhenrin，E-Cad）和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在健康人群和乳腺癌患者中表达有差异，且在TNBC和NTNBC中，E-Cad、EGFR以及组织中叉头框蛋白A1（fork head box protein A1，FOXA1）的表达也有不同[4-5]，但关于血清中E-Cad和EGFR的研究较少，国内外鲜有报道。因此，本研究通过收集乳腺癌患者和健康人群血液样本，比较血清中E-Cad和EGFR的差异，并通过受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价血清E-Cad和EGFR对乳腺癌及TNBC的临床诊断价值，同时预测血清中ECad和EGFR的诊断界值。FOXA1在TNBC的发病、治疗和预后等方面起到重要作用，故通过检测乳腺癌患者组织中FOXA1的表达，进一步研究TNBC和NTNBC中FOXA1的表达差异，为TNBC的早期诊断、治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 患者组选取2015年7月-2016年8月我院经病理检测确诊为浸润性乳腺癌的247例女性患者。其中，三阴性乳腺癌患者（TNBC组）49例（19.80%），中位年龄47岁（23～71岁）。非三阴性乳腺癌患者（NTNBC组）198例（80.20%），中位年龄51岁（26～75岁）。研究符合伦理委员会相关规定，经本院医学伦理委员会批准。

1.1.2 非患者组随机选取来我院体检的健康人群50例，将血清保存备用。

1.2 方法

1.2.1 E-Cad和EGFR的检测取患者清晨空腹静脉血3 ml，4 000 r/min、4℃离心15 min，常规分离血清，备用进行细胞因子的检测。血清可溶性E-Cad和EGFR的含量测定采用酶联免疫吸附试验，试剂盒由上海钰博生物科技有限公司提供。E-Cad和EGFR检测均采用双抗体夹心ELISA法，各孔加入标准品或样品100 μl，37℃避光孵育90 min，然后弃去孔内液体，甩干后直接加入生物素化抗体工作液，继续孵育1 h，然后洗板3次，最后1次洗板甩干后加入酶结合物工作液，孵育30 min后洗板5次，甩干后加入底物溶液，标准孔出现梯度时，加入终止液，使用酶标仪于450 nm处测定光密度值，绘制标准曲线并计算样本中E-Cad和EGFR的含量。

1.2.2 ROC曲线的建立及界值预测采用SPSS 19.0软件进行非参数法建立E-Cad和EGFR的ROC曲线，计算ROC曲线下面积；并以Youden指数最大值作为临界点，计算血清中E-Cad和EGFR的界值，以及灵敏度和特异性。

1.2.3 FOXA1的检测取TNBC组和NTNBC组乳腺癌患者病理石蜡标本及正常乳腺组织标本，分别进行连续切片6张（8 μm/张）。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行操作，用5%血清进行室温封闭40 min后，分别加入1∶1 000的FOXA1单克隆抗体4℃过夜孵育。隔天加入1∶1 000的二抗37℃孵育30 min，PBS清洗后加入SP后进行恒温反应30 min，加入DAB显色液进行显色，中性树胶封片后用×10、×40物镜显微镜进行观察。阳性染色：FOXA1的阳性表达主要表现为细胞内出现棕黄色颗粒。×40显微镜下观察，随机选择5个高倍视野，采用IPP软件进行图像扫描分析，收集数据并计算图片中FOXA1蛋白表达的平均光密度。用于反应组织中FOXA1蛋白的表达含量。平均光密度=累积光密度与面积的比值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）或中位数及四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较采用方差分析或Kruskal-WallisH检验，方差分析采用LSD-t检验，秩和检验两两比较采用Mann-WhineyU检验，采用ROC曲线评价血清E-Cad和EGFR对乳腺癌或TNBC的临床诊断价值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同人群中E-Cad和EGFR表达情况

3组人群E-Cad、EGFR秩和检验分析结果显示，3组间差异有统计学意义（P＜0.01）。与非患者组比较，NTNBC组和TNBC组血清中E-Cad、EGFR表达升高（P＜0.01）；与NTNBC组比较，TNBC组血清中E-Cad表达差异无统计学意义（P＞0.05），EGFR表达升高（P＜0.05），差异有统计学意义。见附表。

2.2 血清E-Cad、EGFR对乳腺癌和TNBC诊断的ROC曲线

结果可见，E-Cad和EGFR对于诊断乳腺癌的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.965（95%CI：0.944，0.986），0.758（95%CI：0.686，0.830）。当 E-Cad 和EGFR的界值分别为1010.7和107.9 ng/ml时，Youden指数最大为0.807和0.385，此时，诊断乳腺癌的敏感性为92.7%和78.5%，特异性为88.0%和60%。由于NTNBC组和TNBC组血清中E-Cad表达差异无统计学意义，所以只对EGFR诊断TNBC进行研究（见图1B），ROC 曲线下面积为 0.776（95%CI：0.703，0.848）。当EGFR界值为139.5 ng/ml时，Youden指数最大为0.473，此时，诊断TNBC的敏感性为79.6%，特异性为67.7%。见图1。

附表 不同人群中E-Cad和EGFR表达比较 [M（P25，P75），ng/ml]

图1 血清E-Cad、EGFR对乳腺癌和TNBC诊断的ROC曲线

2.3 FOXA1的检测结果

3组人群FOXA1平均光密度表达分析结果显示，3组比较差异有统计学意义（F=6.432，P=0.000）。与非患者组FOXA1蛋白含量（0.31±0.04）比较，NTNBC组FOXA1蛋白含量（1.67±0.11）和TNBC组组织中FOXA1蛋白含量（0.87±0.12）表达均上升（P＜0.01）；与NTNBC组比较，TNBC组组织中FOXA1表达降低（P＜0.01），差异有统计学意义，见图2。

图2 各组FOXA1蛋白表达情况 （×400）

3 讨论

乳腺癌作为一种恶性肿瘤，严重危害女性身体健康，未及时诊断乳腺癌会拖延治疗的最佳时间和治疗效果，因此在乳腺癌研究中，除化疗或手术外，尽早发现及确诊肿瘤已成为其治疗的关键[6]。血清指标检查是早期无创性诊断肿瘤的常用手段，能够极大提高诊断方法的顺应性，为尽早发现肿瘤提供重要参考[7]。E-Cad是一种细胞黏附分子，具有维持组织结构完整等功能，在肿瘤侵袭转移中起到重要作用[8]。LIANG等的研究结果表明[9]，相对于健康人群，乳腺癌患者血清中可溶性E-Cad表达升高；LI等的研究表明[10]，与NTNBC患者比较，TNBC组织中E-Cad表达降低，但未见NTNBC患者与TNBC患者血清中ECad含量比较的研究。EGFR是一类跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，并调控细胞增殖作用，高表达的EGFR可促进乳腺癌细胞增殖、转移，并促进肿瘤血管生成[11]。TAS等的研究表明[12]，乳腺癌患者血清中EGFR表达升高，且与NTNBC患者比较，TNBC中EGFR表达较高。本研究结果表明，乳腺癌患者血清中E-Cad和EGFR表达相对健康人群升高，且在TNBC患者中EGFR表达高于NTNBC患者，而E-Cad表达无差异。ROC曲线结果表明，血清E-Cad和EGFR均具有一定的乳腺癌诊断价值，E-Cad（曲线下面积为0.965）诊断价值高于EGFR（曲线下面积为0.758），但在乳腺癌患者中，由于TNBC和NTNBC患者血清中E-Cad表达无差异，不具备TNBC诊断价值，而EGFR具有中等的TNBC诊断价值。本研究以Youden指数作为评价准确度的指标，当E-Cad和EGFR的界值分别为1010.7和107.9 ng/ml时，对于乳腺癌具有较高的诊断价值。当EGFR的界值为139.5 ng/ml时，适用于三阴性乳腺癌的诊断。

ER在乳腺癌的临床进展、诊断及治疗中均有着极其重要的作用，研究表明ER已成为评价患者是否需要内分泌治疗的重要指标。但由于ER在三阴性乳腺癌中呈现阴性表达，TNBC患者对内分泌治疗敏感性较低，因此TNBC临床治疗效果常常不佳[13-14]。FOXA1是一类由472个氨基酸残基组成的转录辅助因子，主要受体内激素调控。ER可诱导乳腺癌细胞表达FOXA1，同时FOXA1又可促进ER转录复合物与染色质的结合上调ER表达，从而提高内分泌治疗的效果[15]。研究表明，FOXA1与乳腺癌患者的预后存在相关性，可作为评价治疗效果良好的标志物[16]。DREW等的研究结果表明，与NTNBC患者比较，TNBC中FOXA1表达阳性率降低[17]，但相关研究文献较少，缺乏文献支持。本研究结果表明，TNBC患者FOXA1表达降低，表明FOXA1可作为TNBC的诊断指标，更为重要的是，FOXA1有可能成为治疗TNBC的关键靶点。但本研究还未对FOXA1与患者化疗效果及预后的相关性展开研究，这可作为下一步的研究方向。

研究健康人群、TNBC与NTNBC患者血清中E-Cad、EGFR，并结合ROC曲线探讨血清E-Cad和EGFR的临床诊断意义，并预测诊断界值，为临床TNBC的诊断提供无创、便捷的血清检测手段；并通过检测FOXA1的表达，为NTNBC的诊断和靶点治疗提供参考。

[1] ANDREOPOULOU E, KELLY C M, MCDAID H M. Therapeutic advances and new directions for triple-negative breast cancer[J].Breast Care(Basel), 2017, 12(1): 21-28.

[2] SATO N, WAKABAYASHI M, NAKATSUJI M, et al. MEK and PI3K catalytic activity as predictor of the response to molecularly targeted agents in triple-negative breast cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 489(4): 484-489.

[3] TEZUKA K, TAKASHIMA T, KASHIWAGI S, et al. Phase I study of nanoparticle albumin- bound paclitaxel, carboplatin and trastuzumab in women with human epidermal growth factor receptor 2-overexpressing breast cancer[J]. Mol Clin Oncol, 2017,6(4): 534-538.

[4] XU H, TIAN Y, LIU Q, et al. CD44 correlates with clinicopathological characteristics and is upregulated by EGFR in breast cancer[J]. Int J Oncol, 2016, 49(4): 1343-1350.

[5] SHEN T, ZHANG K, SIEGAL, et al. Prognostic value of E-cadherin and β-catenin in triple-negative breast cancer[J]. Am J Clin Pathol,2016, 146(5): 603-610.

[6] ORUCEVIC A, CURZON M, CURZON C, et al. Breast cancer in elderly caucasian women-an institution-based study of correlation between breast cancer prognostic markers, TNM stage, and overall survival[J]. Cancers(Basel), 2015, 7(3): 1472-1483.

[7] 龙璐, 陈贞, 王堃, 等. 血清GPC3、GP73、AFP-L3和AFP检测对原发性肝癌诊断的价值[J]. 中国现代医学杂志, 2013, 23(28):46-50.

[8] CHRISTOU N, PERRAUD A, BIONDY S, et al. E-cadherin: A potential biomarker of colorectal cancer prognosis[J]. Oncol Lett,2017, 13(6): 4571-4576.

[9] LIANG Z, SUN X Y, XU L C, et al. Abnormal expression of serum soluble E-Cadherin is correlated with clinicopathological features and prognosis of breast cancer[J]. Med Sci Monit, 2014, 20: 2776-2782.

[10] LI P, SUN T, YUAN Q, et al. The expressions of NEDD9 and E-cadherin correlate with metastasis and poor prognosis in triplenegative breast cancer patients[J]. Onco Targets Ther, 2016, 9:5751-5759.

[11] COSTA R, SHAH A N, SANTA-MARIA C A, et al. Targeting epidermal growth factor receptor in triple negative breast cancer:New discoveries and practical insights for drug development[J].Cancer Treat Rev, 2017, 53: 111-119.

[12] TAS F, BILGIN E, KARABULUT S, et al. Clinical significance of serum epidermal growth factor receptor (EGFR) levels in patients with breast cancer[J]. Cytokine, 2015, 71(1): 66-70.

[13] NAGINI S. Breast cancer: current molecular therapeutic targets and new players[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2017, 17(2):152-163.

[14] 杨虹, 曾福仁, 刘剑仑, 等. ER、PR、HER-2、Ki-67与乳腺癌新辅助化疗疗效相关性分析[J]. 中国现代医学杂志, 2016,26(24): 54-57.

[15] ZHANG X L, WANG H S, LIU N, et al. Bisphenol A stimulates the epithelial mesenchymal transition of estrogen negative breast cancer cells via FOXA1 signals[J]. Arch Biochem Biophys, 2015,585: 10-16.

[16] HU Q, LUO Z, XU T, et al. FOXA1: a promising prognostic marker in breast cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(1):11-16.

[17] DAVIS D G, SIDDUQUI M T, OPREA-ILIES G, et al. GATA-3 and FOXA1 expression is useful to differentiate breast carcinoma from other carcinomas[J]. Hum Pathol, 2016, 47(1): 26-31.