ABA及氟啶酮调控下冬小麦分蘖节抗寒相关蛋白的鉴定与分析

杨 宁，包雨卓，赵浡彤，吕 岩，彭瞰看，田 宇，徐庆华，于 晶，王军虹，苍 晶

(1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030； 2.广东白云学院，广东广州 510450)

低温胁迫是限制小麦产量的主要因素。ABA是重要的植物激素之一。研究证实，外源施加ABA能够促进植物体内ABA的合成和运输，增加渗透调节物质的含量，提高抗氧化酶活性，诱导抗寒相关基因表达以及促进相关酶的重新合成，从而提高植物抗寒性[1-2]。氟啶酮是ABA合成的抑制剂，通过抑制ABA前体物质类胡萝卜素的合成，从而抑制植物体内ABA的合成[3-4]。用氟啶酮作对照，可进一步明确哪些蛋白可能受到ABA的诱导。

双向电泳技术是蛋白质组学研究的关键技术，在植物抗逆相关研究中应用日趋广泛，对植物抗寒等抗性研究已取得了一些进展。Meza-Basso等[5]首次通过双向电泳技术在油菜中发现受低温诱导的蛋白，并在多种植物中得到应用。Hashimoto等[6]采用双向电泳在对低温胁迫下水稻幼苗的研究中发现，水稻叶鞘、叶片和根系在低温处理后出现39个蛋白差异点。Cui等[7]采用双向电泳对不同温度处理下水稻幼苗叶片蛋白进行分离，鉴定到41个低温诱导蛋白。Gao等[8]采用双向电泳在对盐芥莲座叶响应低温胁迫的蛋白研究中发现，所有参与RNA代谢、防御和蛋白代谢的蛋白质都显著上调。

东农冬麦1号是首例可在北方高寒地区安全越冬的强抗寒冬小麦品种，返青率大于85%。本课题组前期研究发现，东农冬麦1号分蘖节是其物质准备能力和抗寒代谢适应最强的器官，在冬小麦安全越冬中起重要作用[9]。鉴于此，本试验以东农冬麦1号为材料，于三叶期分别外源喷施10 μmol·L-1ABA和50 μmol·L-1氟啶酮，待大田自然降温至4 ℃和-25 ℃时取分蘖节，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对各处理组全蛋白进行分离，然后进一步采用双向电泳分离蛋白，筛选出与ABA调控相关或与低温应答相关的差异蛋白后进行质谱分析，探讨外源ABA对低温下冬小麦蛋白质组的影响，进而揭示冬小麦抗寒的蛋白质基础及其与ABA调控的关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料种植及取样

供试冬小麦(TriticumaestivumL.)材料为东农冬麦1号，由东北农业大学小麦育种研究室提供。

选取籽粒饱满一致的冬小麦种子于东北农业大学试验田播种。完全区组设计，3次重复，小区行长1.5 m，10行区，行距0.2 m，播种量为450粒·m-2，播深5 cm，常规管理。待冬小麦生长至三叶期时，分别采用10 μmol·L-1ABA、50 μmol·L-1氟啶酮(二者浓度为前期试验确定的最适浓度)进行叶面喷施，用量为0.25 L·m-2，以喷施等量蒸馏水为对照。分别于10 d最低温平均4 ℃和-25 ℃时取样。各处理分别取50株长势相似的麦苗，将分蘖节剪成0.5 cm的小段，混匀后用液氮迅速冷冻，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 全蛋白的提取、裂解及定量

全蛋白的提取参照Damerval等[10]的方法并略作改进。取1.0 g样品在液氮中充分研磨，转入50 mL离心管中。加入10 mL预冷的10% 三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液，于-20 ℃冰箱放置45 min。4 ℃、16 000 r·min-1离心15 min，弃上清，重悬沉淀。加入10 mL预冷的10% TCA/丙酮溶液，于-20 ℃冰箱放置45 min。4 ℃、16 000 r·min-1离心15 min，弃上清，沉淀中加入预冷的80%丙酮，振荡混匀后于-20 ℃冰箱放置45 min(重复两次该步骤)。弃上清，沉淀低温冷冻干燥成粉末状。

在上述所得到的粉末状蛋白质样品中加入500 μL裂解液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、65 mol·L-1DTT、2% IPG buffer)混匀，涡旋振荡20 min，4 ℃过夜。取上清，用蛋白质定量试剂盒(2-D Quant-Kit，GE-Healthcare)定量。

1.3 蛋白双向电泳

根据蛋白质含量吸取一定体积的蛋白溶液，加适量水化液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、2% CHAPS、20 mmol·L-1DTT、0.5% IPG buffer、0.1%溴酚蓝)补齐至450 μL，加入胶条槽中，用24 cm IPG strip覆盖，通过Ettan IPGphor Ⅲ(GE-Healthcare)进行等电聚焦，聚焦程序设置为：主动水化30 V 10 h，200 V 1 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，4 000 V 1 h，8 000 V 1 h，64 000 Vh聚焦，500 V维持。

第一相等电聚焦结束后，将胶条取出置于放入10 mL胶条平衡缓冲液Ⅰ[6 mol·L-1尿素、75 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.8)、29.3%甘油、2% SDS、0.002%溴酚蓝、1% DTT]的水化盘中，平衡15 min。取出后再放入10 mL胶条平衡缓冲液Ⅱ[6 mol·L-1尿素、75 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.8)、29.3%甘油、2% SDS、0.002%溴酚蓝、2.5%碘乙酰胺]中平衡15 min。平衡完毕后，将胶条在电极缓冲液中浸泡2 s后转移到12.5%的SDS-PAGE凝胶上，低熔点琼脂糖封胶后，应用Ettan Dalt Six(GE-Healthcare)进行第二相SDS-PAGE电泳，20 ℃恒温下，1 W 30 min，13 W直至溴酚蓝移至凝胶底部，电泳停止。

1.4 染色与脱色

电泳结束后，将胶块取出置于20%TCA中固定15 min后，用染色液(450 mL蒸馏水、450 mL无水乙醇、100 mL冰乙酸、2.5 g考马斯亮蓝R250)染色2 h后，转至脱色液中(450 mL蒸馏水、450 mL无水乙醇、100 mL冰乙酸)中，不断更换脱色液直到条带清晰可见。

1.5 凝胶扫描及质谱分析

待凝胶背景清晰后，用Ettan Image Scanner扫描仪拍照后，将凝胶保存于含有10%冰乙酸的溶液中。利用ImageMasterTM2D Platinum 7.0软件(GE Healthcare)对图像进行分析，筛选出差异表达的蛋白点，选择相对体积改变大于2倍的蛋白点，借助SPSS进行分析，选择其中差异倍数在2倍以上的24个蛋白点切胶后进行质谱分析。

用含50%乙腈的25 mmol·L-1碳酸氢铵洗脱后乙腈脱水。56 ℃下用10 mmol·L-1DTT打开二硫键，然后暗处55 m mol·L-1IAM处理，进行半胱氨酸的烷基化封闭，最后用胰蛋白酶溶液裂解。裂解液用MALDI-TOF/TOF进行肽指纹图谱及二级质谱测定。质谱仪检测时设置参数为：检测模式为反射模式，谱图质量范围为500～3 500 Da，分辨率为50 000。默认每张一级谱图选择5个母离子进行二级鉴定。蛋白质胶点鉴定主要是通过试验产生的质谱数据，与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配，从而得到蛋白质鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 各处理组冬小麦分蘖节的双向电泳图谱

4 ℃时，各处理组双向电泳结果如图1。对图1各处理组进行软件分析，得到可匹配的蛋白点587个。ABA处理组与对照组相比，133个蛋白点差异表达变化量达到2倍以上，其中，115个蛋白点上调，18个蛋白点下调(图1a、图1b)；氟啶酮处理组与对照组相比，59个蛋白点差异表达变化量达到2倍以上，其中，31个点上调，28个点下调(图1a、图1c)；ABA处理组与氟啶酮处理组相比，差异表达变化量达到2倍以上的点有64个，其中36个点上调，28个点下调(图1b、图1c)。

25 ℃时，各处理组双向电泳结果如图2。对图2各处理组进行软件分析得到可以匹配的蛋白点394个。ABA处理组与对照组相比，61个蛋白点差异表达变化量达到2倍以上，其中，41个蛋白点上调，20个蛋白点下调(图2a、图2b)；氟啶酮处理组与对照组相比，84个蛋白点差异表达变化量达到2倍以上，其中，29个点上调，55个点下调(图2a、图2c)；ABA处理组与氟啶酮处理组相比，差异表达变化量达到2倍以上的点有65个，其中34个点上调，31个点下调(图2b、图2c)。

a：对照组；b：ABA处理组；c：氟啶酮处理组。图2同。

a:Control; b:ABA treatment; c:Fluridone treatment. The same in figure 2.

图14℃时各处理组的2-DE图谱

Fig.12-DEmapsofeachtreatmentat4℃

2.2 差异表达蛋白点的选择和质谱鉴定结果

对各处理之间差异倍数达到2倍以上的蛋白点进行筛选，选择在低温下变化倍数较大及在ABA处理组和氟啶酮处理组中变化相反的23个蛋白点，和低温下消失的蛋白点1个，共24个蛋白点(图3)。其中，21个(点1～14、点16～17、点19～23)在ABA处理组中上调，而在氟啶酮处理组下调；2个(点15、点18)在ABA处理组中下调，而在氟啶酮处理组上调；1个(点24)在4 ℃特异表达，-25 ℃消失的蛋白点。对以上筛选到的24个蛋白点进行质谱分析，均得到了完整的肽指纹图谱，Mascot数据库检索结果如表1示，其中15种为已知蛋白，9种未知蛋白。

由图4可知，鉴定出的蛋白与谱图匹配的肽段长度占整个蛋白长度40%～100%、35%～40%、30%～35%、25%～30%的分别有28%、20%、11%、11%，说明鉴定出的蛋白覆盖率较高，有较高的可信度。

图3 4 ℃下进行质谱分析的蛋白点

2.3 差异蛋白的功能分析

已鉴定出的差异蛋白可分为逆境蛋白、代谢相关蛋白、转录翻译相关蛋白和未知蛋白。逆境蛋白包括低温诱导蛋白16(点1)、低温响应RNA结合蛋白(点2)、冷调节蛋白(点16、点17)。代谢相关蛋白包括磷酸甘油酸变位酶(点4)、磷酸甘油酸激酶(点23)、ATP合酶β亚基(点5)、谷胱甘肽S转移酶1(点7)、26S蛋白酶非ATP酶调节亚基(点10)、谷胱甘肽转移酶(点11)和谷胱甘肽转移酶F5(点15)。转录翻译相关蛋白包括新生多肽相关复合物β亚基(点3)、4A真核起始因子(点6)和真核翻译起始因子5A3(点24)。未知蛋白包括点8、9、12、13、14、18、19、20、21和22。

表1 质谱分析结果Table 1 Results of mass spectrometry

图例中，百分数表示蛋白鉴定覆盖率，括号内数字表示覆盖率范围内的蛋白种类数。

In the legend,the percentage indicates protein sequence coverage,and the data in the parenthesis indicates the number of protein species within that sequence coverage.

图4蛋白鉴定覆盖率分布

Fig.4Distributionofproteinsequencecoverage

3 讨 论

3.1 逆境蛋白

低温诱导蛋白16(cold induced 16, WCI16)(点1)是冬小麦在冷驯化期间诱导的一种蛋白，Sasaki K等[11]的研究从晚期胚胎发育蛋白(late embriogenesis abundant protein, LEA)通常具有的4个特征(超亲水性、沸腾溶解度、应力诱导性和应激保护性)证明了WCI16可能代表一类新的LEA蛋白。植物LEA蛋白被认为是一种逆境响应蛋白，低温、干旱及ABA等均可诱导其表达，其中ABA是LEA蛋白基因表达的重要调节因子，根据LEA蛋白基因表达是否依赖ABA可分为ABA依赖型和非ABA依赖型[12]。本试验中WCI16在ABA处理组与氟啶酮处理组表达量变化相反的特点，说明该蛋白可能是ABA依赖型LEA蛋白。

RNA结合蛋白(RNA-binding protein, Rbps)是基因表达转录后调控的关键蛋白[13]，植物中编码该蛋白的基因在玉米、拟南芥、烟草和大麦等植物中均被克隆得到。研究表明，拟南芥中编码该蛋白的多个基因表达量在低温条件下显著增加[14]，与本研究中低温响应RNA结合蛋白(low temperature-responsive RNA-binding protein, LTR-Rbps)在低温ABA处理下表达量上调的趋势一致，而在ABA处理组与氟啶酮处理组表达量相反的结果则表明，低温响应RNA结合蛋白受到外源ABA的诱导。

冷调节蛋白(cold regulated protein, CORPs)(点16、17)是大多数植物在低温驯化诱导条件下产生的一类特异性蛋白，研究发现，除低温外，外源ABA、盐胁迫、干旱、热激等逆境胁迫均能诱导CORPs产生[15]。本试验得到的COR蛋白WCOR18与之前报道过的大麦COR蛋白Tma-ap3具有高度同源性[16]。

3.2 代谢相关蛋白

磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase, PGAM)(点4)是糖酵解和糖异生途径中催化3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸相互转化的关键酶，一般分为辅因子依赖型PGAM(dPGAM)和辅因子非依赖型PGAM(iPGAM)，其中，iPGAM广泛分布在植物中，并且在响应非生物胁迫中起重要作用。Amme等[17]在拟南芥的低温胁迫研究中发现，AtiPGAM1表达量显著升高，说明AtiPGAM1在植物遭受冷胁迫时起正调节作用。本试验中PAGM在低温和ABA处理下表达量上升，说明该酶能够响应植物的低温胁迫，并可能受到外源ABA的诱导。

磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)(点23)的主要功能是作为糖酵解途径的关键酶，催化1,3-二磷酸甘油酸转化成3-磷酸甘油酸的过程，并产生1分子ATP，逆反应生成1分子ADP[18]。PGK在非生物胁迫下表达量升高产生ATP以增强植物抗性，该结果在水稻[19]和豌豆[20]均已被证实。本研究中PGK在低温和ABA处理下表达量升高，说明PGK能够提高植物在低温胁迫下的抗性，一定量的ABA可能诱导PGK表达量升高从而增强植物抗逆性。

20S蛋白酶体能选择性降解氧化胁迫受损的蛋白，这一功能不依赖ATP和泛素[21]。本研究中得到的26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit, 26SRP)(点10)在低温下表达量增加，可能是为了清除低温胁迫中被氧化的正常蛋白质，在ABA处理下表达量增加结果则表明，该蛋白可能受到外源ABA的诱导。

ATP合成酶广泛分布于线粒体膜和叶绿体类囊体膜上。作为在高等植物能量代谢中的关键酶之一，它跨膜质子动力促进合成ATP，参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。本试验中ATP合成酶β-亚基(ATP synthase subunit beta, ATPase-β)(点5)的表达量上调这一结果与Kong等[22]在 OsNAS1转基因甘蓝型油菜盐胁迫条件下得到的结论一致。基于以上推测，ATP合成酶β-亚基在低温下ABA处理后参与离子转运能力增强，从而降低细胞渗透势，提高植物的抗寒性。

谷胱甘肽转移酶在植物的初级代谢和次级代谢、耐受胁迫和细胞信号转导过程中行使许多不同的功能，从而影响植物的生长发育。植物GST家族中的许多成员都与植物抗逆性有关，如对除草剂、高盐、低温和紫外辐射等的抗性[23]。Harshavardhanan等[24]在关于甘蓝GST的全基因组表征研究中，发现BoGST基因具有潜在的抗寒功能。本研究中谷胱甘肽S转移酶1(glutathione S-transferase 1, GST1)(点7)、谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)(点11)在低温下ABA处理后表达量上调，而谷胱甘肽转移酶F5(glutathione transferase F5, GSTF5)(点15)则下调，这一结果表明GST参与植物应对低温胁迫的调控过程，一定浓度ABA能提高植物抗寒性。点15表达量下调，则可能是由于这三种不同的谷胱甘肽转移酶调控的反应不同导致的，点7、点11和点15的调控机制仍有待进一步研究。

3.3 转录翻译相关蛋白

新生多肽复合物β亚基(点3)即为基本转录因子3(basic transcription factor 3, BTF3)。有研究从小麦中克隆到一个受冻害胁迫诱导表达上调的BTF3家族基因 TaBTF3，该基因在盐、干旱、冷、ABA、MeJA和SA胁迫处理下均被诱导表达上调[25]，这与本试验得到的该蛋白在低温、ABA处理下表达量上调的结果一致。

本研究中真核翻译起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A, eIF4A)(点6)在低温ABA处理条件下表达量增加，能够增加其与真核基因启动子区域中顺式作用元件的特异性结合，通过与其他相关蛋白的相互作用，激活转录过程，增强目的基因的表达强度，增加目的蛋白的表达量，从而影响植物抗寒能力。与Stockinger等[26]在研究拟南芥中由 CBF1编码含有转录因子的AP2结构域在低温胁迫条件下的调节作用时也得到类似的研究结果。

真核细胞翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A3, eIF5A)是真菌、动植物体内普遍存在的蛋白质翻译起始因子。拟南芥的研究中发现了三个表达特征不同的eIF5Ab编码基因[27]，其中，eIF5A3在细胞分裂活跃的吸胀种子中高表达，在拟南芥中过表达eIF5A3，花瓣从正常的四瓣变为五瓣，叶子变为并生叶，种子变为原来的两倍大，说明eIF5A3在发育早期促进细胞分裂。本研究中真核翻译起始因子5A3(点24)在4 ℃下特异表达，该时期恰好是冬小麦分蘖的旺盛期，与其分蘖节的细胞增殖相适应，而在-25 ℃时该蛋白消失，与小麦在-25 ℃低温下细胞分裂停滞相一致，可能是低温下eIF5A3不表达的结果。

综上所述，植物应对低温是一个复杂的调控过程。本研究发现外源ABA处理下，与对照组相比出现显著差异的蛋白可分为逆境蛋白、代谢相关蛋白和转录翻译相关蛋白。其中，代谢相关蛋白最多，包括物质代谢和能量代谢。糖代谢相关蛋白在ABA处理下表达量上调，促进植物新陈代谢，为抵御外界胁迫提供一定动力，本课题组前期研究也发现，ABA对东农冬麦1号糖代谢有促进作用[1]。ATP合成酶相关蛋白在ABA处理后表达量上调，为植物体内抵抗胁迫的各种代谢活动提供能量。有两种低温诱导的转录因子在ABA处理组表达量上调，通过在转录水平调控相关目的蛋白的表达量，从而增强植物抗寒性。逆境蛋白都在ABA处理组上调，氟啶酮处理组下调，说明ABA对冬小麦抗逆性的提高起重要作用。此外，本研究还有10种未知蛋白，这主要由于小麦的蛋白信息相对比较匮乏，但近年来蛋白质组学发展迅速，相信随着蛋白质数据库的不断完善，这些问题会很快得到解决。

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