显微注射法利用胚胎干细胞制备嵌合鼠的研究

马玉娥

（苏州大学剑桥-苏大基因资源中心，江苏苏州215123）

在当今生物医学研究中，嵌合体制备技术发挥着非常重要的作用，已被广泛应用于遗传学、胚胎学、毒理学、发育生物学、细胞生物学和医学等众多研究领域[1-3]。将经基因修饰的胚胎干（ES）细胞导入小鼠植入前胚胎制备的生殖系传递的嵌合个体，已成为基因功能和致病机理等方面研究的重要模式。所谓嵌合体是指由两种或两种以上具有全能性和多能性的细胞系发育而成的复合体。目前，制备嵌合体主要有显微注射法、聚集法和共培养法三种。

显微注射法是通过使用显微操作仪将ES细胞注入胚胎中制备嵌合体。聚集法是较受欢迎的制备嵌合体的方法，仅次于显微注射法，它是将去除透明带的4-细胞期或8-细胞期胚胎或桑葚胚与ES细胞置于聚集培养液中进行聚集，该方法不需要昂贵精密的仪器，操作简单、效率高，但成功率低。由于需要较多的胚胎进行操作，而近交系小鼠因其产卵量少不适合此方法。另外，因其无法对ES细胞进行质量筛选，导致在体外培养和操作时间长，易受理化因素的影响。共培养法是将ES细胞同去除透明带8-细胞时期胚胎培养，该方法可同时对大量胚胎进行操作，技术简单，不需要贵重的仪器，但成功率低，当前研究中很少使用该方法。本文结合最常用的方法—显微注射法及其制备嵌合体影响因素的最新进展进行综述。

1 显微注射法

显微注射法制备嵌合体最早由Gardner于1968年创建，其通过囊胚腔注射法成功获得嵌合体[4]。1984年Bradley等[5]首次成功获得生殖系传递的嵌合小鼠，使用的也是囊胚腔注射法，此后该方法才逐渐发展成熟，并得以广泛应用。所谓显微注射法是指通过显微注射仪将挑选好的一定数目的ES细胞注入胚胎中，一般采用囊胚注射，也有实验室采用8-细胞注射，即选用的是不同发育阶段的胚胎。但囊胚注射被认为是获得嵌合体的最常用和最经典的方法。其优点是可在显微镜下挑选光滑、圆形的形态质量好的细胞，受到体外各种因素的影响也会因胚胎和干细胞在体外暴露的时间短而明显减少。另外，该方法稳定、重复性强、成功率高，但也存在一定的缺点：需要昂贵的仪器设备和熟练的操作技能，效率低，平均每小时只能注射20～40枚囊胚，一天注射的胚胎数量极限为100个。8-细胞注射主要是将ES细胞注入8细胞期胚胎的卵裂球间隙。该方法可以获得较多的嵌合鼠，这是由于8细胞晚期胚胎的分裂球开始致密化，分裂球间建立了各种连接，此时引入ES细胞，很容易与宿主细胞之间建立联系。但该方法中注射针易伤及卵裂球，造成胚胎的损伤，不利于嵌合胚的生长发育。近年来，压电微操作系统（Piezo）的应用，成功地解决了注射针损伤胚胎的难题，极大地提高了注射成功率和注射效率。有研究表明，与传统的注射方法相比，通过应用Piezo设备，可以提高嵌合体小鼠的出生率和雄性嵌合鼠数目，而且对胚胎无伤害[6]。但该方法因需要额外投入昂贵的仪器以及对操作技能的更高要求而未得到广泛的应用。目前，使用传统的显微注射法将来源于C57BL/6品系的ES细胞注入远交或近交白化鼠囊胚已成为一种标准的注射方法。

2 嵌合体制备影响因素

显微注射法制备嵌合体小鼠除受操作技巧熟练程度的影响，还受ES细胞的影响，包括ES细胞特性、质量、背景及注射时挑选的ES细胞数目。

2.1 ES细胞的特性

1981年，Evans等[7]首次报道了从正常小鼠胚胎中分离建立了胚胎多能干细胞系，简称ES细胞。该细胞具有在体外无限增殖能力和多方向分化潜能以及种系嵌合能力的特性，而ES细胞的全能性保持是制备嵌合体的先决条件。维持ES细胞增殖同时抑制其分化倾向，其分化全能性才得以保持，否则意味着嵌合体制备的失败。

ES细胞对培养条件要求非常严格，不仅需要优质的培养液来提供必需的营养成分和能源物质，还需要足够的分化抑制因子，如白血病抑制因子（LIF），维持其未分化状态[1]。研究表明，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上清液培养体系不仅能长期有效维持小鼠胚胎干细胞的增殖，并且能够有效地抑制其分化[8]。Ramire等[9]发现注射前2h更换新鲜ES细胞培养液可提高制备嵌合鼠的效率，这是由于通过该操作，细胞的活性得到增加。

2.2 ES细胞的数目和质量

前期研究数据表明，引入早期胚胎的ES细胞数目会影响嵌合体的制备。细胞数目过少会使获得的嵌合体的嵌合率很低；过多则会使早期胚胎生长发育异常，易在孕中期被吸收。要保证出生的小鼠有较高的嵌合率和正常发育率，Robert等[10]发现注射的ES细胞数目一般为5～10个或10～15个。有研究表明注入多个ES细胞可提高其与宿主囊胚细胞的竞争力，推测其原因：一是多个ES细胞相互间可通过分泌未知因子来维持其存活和发育能力，二是多个细胞增加了整合到ICM的概率[11]。通常情况下，为得到较高的嵌合效率，注入囊胚的ES细胞数目控制在10～15个。

除引入早期胚胎的ES细胞数目外，其质量也会影响嵌合体制备成功率。ES细胞的质量受培养环境和传代次数影响。培养环境不良会使ES细胞核型不稳定，易发生基因外改变等异常现象。异常的ES细胞无法通过形态被确认，且不具备正常的发育能力，导入后会使ES细胞数目难以与嵌合体发育形成准确的对应关系[2]。另外，ES细胞的传代次数越高，核型越不稳定，易发生遗传性变异，从而导致小鼠遗传背景的不稳定，降低了嵌合体小鼠制备的成功率。因此，在实验中一般选择传代次数低的细胞[3]。但传代次数过低会易导致杂细胞较多，增加挑选细胞的难度，降低注射效率。

2.3 ES细胞和宿主囊胚的遗传背景

在嵌合体鼠的制作过程，供体和受体鼠的遗传背景不匹配同样会影响嵌合体制备的成功率。目前，有关供体鼠和受体鼠组合的研究报道很多，通常可对出生后的嵌合个体进行初步判断，依据是细胞来源小鼠品系和供体鼠之间存在的毛色差异。129品系ES细胞由于稳定和易于种系嵌合等因素常被用来做基因修饰性小鼠模型，但129背景的鼠繁殖力差，免疫和行为方面容易异常，并且在获得打靶动物后还需要回交到C57BL/6品系，比较耗时耗力[12-13]。而C57BL/6品系却不存在这些不足，且不需要回交到C57BL/6，不仅节省了时间，还避免因背景不纯引起的不稳定结果。另外，该品系已经用来进行小鼠全基因测序，遗传背景信息丰富且清楚。因此，目前C57BL/6背景的ES细胞被认为是用于同源重组的最佳选择。

随着国际敲出小鼠联盟（IKMC）使用C57BL/6N品系的ES细胞制作嵌合鼠的影响力不断扩大，目前越来越多的研究致力于利用C57BL/6N品系的ES细胞和不同品系的受体鼠胚组合来提高生殖嵌合力。Thomas等[14]选用C57BL/6N和C57BL/6J的小鼠品系作为供体胚，注入C57BL/6N来源的ES细胞，发现C57BL/6J鼠胚的生殖嵌合率显著高于C57BL/6N。Tuija等[15]通过分别向BALB/c和Tyr鼠胚中注入C57BL/6N ES细胞并进行比较分析，发现虽然Tyr鼠在囊胚获取量上存在优势，但BALB/c鼠在小鼠出生率、嵌合率、雄性嵌合率、生殖嵌合率方面均高于Tyr鼠，表明BALB/c鼠胚较适合C57BL/6N ES细胞注射。

此外，需要注意的是，显微注射过程中，要挑选小的，光滑的，圆形的ES细胞。细胞不能过小，否则会吸入较多的培养液，注射到囊胚腔后会稀释其中的重要因子；过大会被挤压，导致变形，影响细胞质量，通常以注射针的直径大小为宜。注射针中吸取的ES细胞数目不要太多，否则细胞易挤压变形，易发生黏针、堵针，增加操作的难度，而且细胞的质量和数目会受到影响。另外，移植体品系的选择，移植等技术环节都会影响嵌合体的成功制备。

3 结语

嵌合体制备技术不仅在生物医学研究中发挥着巨大的作用，如研究基因功能、探究人类疾病机理、研究细胞分化机制等，而且在畜牧生产上有着广泛的应用前景：培育动物新品种（高产，优质，抗病等），而利用四倍体胚胎补偿技术（即以四倍体囊胚为宿主获得的嵌合体）和其他技术结合可以达到优良性状或濒危动物遗传资源保种目的。但如何高效获取嵌合体的问题仍需要去研究和解决，本文阐述了嵌合体制备的最常用方法-显微注射法以及嵌合体制备的影响因素，对高效获取嵌合体具有一定的指导意义。