杉木种鳞石蜡切片工艺优化研究

左丹丹 熊 升 李 佳 饶丽莎 林思祖 陈 宇

(1. 福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2. 国家林业局杉木工程技术研究中心，福建 福州 350002)

杉木 (Cunninghamialanceolata)，是我国南方重要的优良造材树种，具有重要的经济价值。裸子植物种鳞是球果的主要组成部分，不仅与被子植物花瓣一样起到保护作用，还能进行光合作用，为种子发育提供养分。学者通过对初级种子园杉木、第1代、1.5代、第2代、第3代杉木种子园的杉木球果进行了大量研究，并将其与种子性状联系起来[1-7]，结果表明种子质量与球果形态具有相关性，但种子质量与杉木种鳞内部细胞结构的相关性研究极为缺乏，因此，开展对杉木种鳞微结构的深入研究非常有必要。

石蜡切片具有成本低、制片薄、切片连续且可永久保存等优点，在植物器官发育及其解剖学研究中应用广泛[8]，但不同材料的软硬条件不同，要得到理想的效果，必须对切片工艺进行不断摸索，从而找到最适合的制片条件[9-10]。杉木种鳞表面含有较厚的蜡质层，且木质化严重，采用常规石蜡切片法，则很难得到完整的蜡带。如果试图通过石蜡切片方法观察杉木种鳞的内部解剖结构，石蜡切片工艺的改良就尤为重要。本研究以杉木种鳞为实验材料，在常规石蜡切片工艺的基础上，根据杉木种鳞的结构特性，通过对软化、脱水、透明、浸蜡等步骤进行系列优化与改进，以期建立适合杉木种鳞的石蜡切片工艺，为进一步研究杉木种鳞发育过程提供新的实验方法和手段。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究以生长于福建省三明市尤溪县国有林产的杉木球果为材料，选择生长良好、无病虫害发生的植株，在1年生枝条或当年生新梢上，采摘良好无病态的球果作为实验材料。采样时间为2016年6月中旬。对采摘的球果进行人工剥取，分样贴好标签后置入固定液中抽气处理，随后固定3 d以上，放入4 ℃冰箱备用。实验在福建农林大学海峡联合研究院基因组中心开展，于2016年7月份进行。

1.2 试验方法

1.2.1固 定

将剥取的新鲜材料进行人工分割成1 cm × 0.5 cm小块，立即放入已配好的2种固定液中：FAA固定液：70%乙醇90 mL + 冰醋酸5 mL + 甲醛5 mL；FPA固定液：70%乙醇90 mL + 丙酸5 mL + 甲醛5 mL。分别抽气3次，每次5 min，抽气后更换新鲜固定液于4 ℃冰箱固定保存。由于种鳞材质较硬，试验中材料与固定液的比值 ≥ 1∶20，且固定时间 ≥ 3 d，以免细胞固定不彻底。

1.2.2软 化

对于材料的软化处理，应选择最适合杉木种鳞材质的方法。本研究设计了3种软化方法，分别为甘油-乙醇软化法、乙二胺浸泡法[11-12]和盐酸浸泡法[13]，并用未软化处理的样品做对照，见表1。

1.2.3脱水与透明

软化结束后将材料充分洗涤后进行脱水、透明处理。因为杉木种鳞表面具有很厚的蜡质层，鉴于此，本实验设计了不同的脱水和透明时间，具体见表2。

表1 不同软化处理Table 1 Different softening treatments

表2 脱水与透明处理Table 2 Dehydration and transparent optimization

1.2.4浸 蜡

在石蜡切片的制备过程中，浸蜡的目的是让石蜡缓慢渗入到组织内从而将透明剂代替出来，一般按照从低温到高温顺序进行， 是切片制备关键步骤之一，因此对工艺优化至关重要。

1.2.5包 埋

此操作在徕卡包埋机上进行。用A4纸折成适当大小的纸盒，接入纯蜡，置于冷凝台，立即将材料放入盒中，用热镊子摆正材料，放在固定统一的位置，将要切的面置于底部。静置至石蜡凝固，期间应补蜡2～3次，以免石蜡凝固后凹陷，不利于后期试验的进行。

1.2.6修块、粘固

将包埋好的蜡块撕去纸盒，进行修块。将蜡块修成梯形，上、下两面修成平行面 (以便切出的蜡带完整)，将修整好的蜡块固定在包埋盒上。

1.2.7切片、粘片、展片

粘固好的蜡块进行切片，切片厚度为10 μm。切出长度合适的蜡带，用牙签挑到40 ℃的粘片机中，将蜡带展开；使载玻片垂直插入水中，再用牙签轻挑到载玻片上，将玻片放置于40 ℃的展片台上，最后将合格的切片转入40 ℃温箱中烘干。

1.2.8染 色

番红固绿染色是一个需要探索的过程，染料的浓度、时间都需要依材料来改进。本实验针对染色中番红、固绿不易着色现象进行改进，对比染料的不同浓度、时间及其染色结果，从而选出最优染色方法。如表3所示，试验1号采用普通番红，试验2号采用改良版番红进行染色。 (此番红为索莱宝公司推出的改良版番红，较其他番红而言，颜色更正，着色时间短、力度强，大大缩短试验时间，提高效率。)

表3 染色优化处理Table 3 Dye optimization

1.2.9封片、烘片

中性树胶封片，封片后将玻片置于55 ℃温箱中烘2～3 d。

1.2.10显微观察与摄影

通过徕卡DMi8倒置显微镜对烘干制片的切片进行观察，对所需切片进行拍照。

2 结果与分析

2.1 不同固定液固定效果比较

如图1a、1b所示，无论是FAA固定液还是FPA固定液固定的材料，经切片后，细胞结构均完整，轮廓清晰，无萎缩变形现象，细胞核和淀粉粒相对完整，表明这2种固定液都适合于杉木种鳞石蜡切片的前固定。

2.2 不同软化处理方法效果比较

对经过不同软化处理的种鳞进行石蜡切片，并与未经软化处理的种鳞进行对比。结果可见：乙醇甘油溶液浸泡的材料切片后，材料破碎，无法得到完整蜡带 (图2a)，与未软化处理的对照组差异不明显 (图2d)；经乙二胺浸泡处理后的材料能够与石蜡融合，但内部仍有部分木质化，且细胞皱缩变形严重 (图2b)；经盐酸溶液浸泡12 h的种鳞能够与石蜡融合，且可以得到连续的蜡带 (图2c)。由以上结果可知，采用12 h盐酸溶液浸泡这一软化处理即为最优处理。

图12种固定液对杉木鳞片固定效果比较
Fig.1 Comparison of 2 kinds of fixative solution on fixation effect ofC.lanceolatascales

图2不同软化方法对杉木鳞片软化效果比较
Fig.2 Comparison of different softening methods on softening effect ofC.lanceolatascales

2.3 不同脱水和透明方法比较

通过表2中的几种脱水、透明处理，结果发现：1号脱水时间为1 h的处理组，将材料放入纯二甲苯时有大量白色沉淀出现；2号脱水时间为每级1.5 h的处理组，当材料放入纯二甲苯时出现少量沉淀；3号、4号脱水时间分别为每级2、2.5 h的处理组，未见沉淀出现。这表明 1、2号处理的材料在乙醇梯度中脱水不彻底，这会严重影响后续的透明和浸蜡环节。对3号、4号材料的切片观察，由图3b可见，4号处理切片时出现蜡带不完整，材料破碎现象，表明4号脱水、透明时间过久，导致材料偏脆，影响后期的切片。因此，杉木种鳞脱水、透明最优时间为3号，其中脱水每级为2 h (100%乙醇分2次)，可将材料彻底脱水；透明每级1 h，且透明过程逐级细分为5步，既不会使材料变脆，又能很好的达到透明效果，由图3a可见材料细胞完整，无变形破碎现象。

2.4 不同浸蜡方式和时间效果比较

浸蜡效果与蜡的选择、浸蜡次数和时间的选择均相关。可先选择低熔点的54 ℃石蜡，再选择熔点高的60 ℃石蜡，这2种蜡均需提前熔化过滤备用。在装有材料的青霉素小瓶中加入2/3二甲苯、1/3石蜡 (熔点54 ℃)，放入45 ℃烘箱中过夜；次日将已熔石蜡及二甲苯倒出 (用回收瓶收好，切勿倒入池中，以免堵塞管道)，再加入1/3二甲苯、2/3石蜡 (熔点54 ℃)，置于50 ℃烘箱3 h；倒空后加入已熔好的纯石蜡 (60 ℃)，转入65 ℃烘箱，之后每6～12 h换1次纯蜡，换2～3 d即可。

图3不同脱水、透明对杉木鳞片软化效果比较
Fig.3 Comparison of different dewatering and transparence on softening effect ofC.lanceolatascales

2.5 不同染色方法效果比较

染色也是至关重要的一个环节。染色前要对切好的切片进行脱蜡、复水，脱蜡一定要彻底。将装有切片的染色架放入65 ℃烘箱5～10 min，蜡带熔化后，立即转入纯二甲苯中进行脱蜡。完成脱蜡、复水后立即开始染色，图4a为传统方法染色，细胞核、表皮细胞和木质部等均无着色，只有细胞壁染成绿色；图4b为采用改良的番红固绿试剂进行染色，大大提高了番红的着色时间和牢固性，只需染色20 min，细胞核、表皮细胞和木质部等即可染成鲜红色。其具体步骤为：烘蜡 (5～10 min)→ 纯二甲苯 (20 min，2次)→ 1/2二甲苯 + 1/2乙醇 (5 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 95%乙醇 (2 min)→ 85%乙醇 (2 min)→ 70%乙醇 (2 min)→ 1%番红 (20 min)→ 70%乙醇 (3 min)→ 85%乙醇 (3 min)→ 95%乙醇 (3 min)→ 固绿 (1 min)→ 95%乙醇 (2 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 1/2二甲苯 + 1/2乙醇 (2 min)→ 纯二甲苯 (2 min，2次)。

图4不同处理对杉木鳞片染色效果比较
Fig.4 Comparison of different treatments on dyeing effect ofC.lanceolatascales

3 结论与讨论

目前国内外有关裸子植物种鳞解剖学研究较少，而杉木种鳞的细胞学研究更是极为罕见，适合种鳞的石蜡切片技术尚未见报道，有关杉木的解剖学和细胞学研究都停留在杉木叶片上[14-16]。本研究着眼于杉木种鳞这一组织入手，针对杉木球果木质化且蜡质层厚的特点，对传统石蜡切片工艺进行优化改良，最终得出杉木种鳞石蜡切片的优化工艺。并应用此优化工艺，以杉木种鳞为实验材料，通过取材、固定 (FAA或FPA固定液)、盐酸浸泡软化、乙醇梯度脱水、二甲苯梯度透明、浸蜡、包埋、修块、切片、染色、封片、拍照等步骤，制备出完全符合组织精准观察、结构清晰完整的杉木种鳞细胞结构图。通过此研究可得出杉木种鳞石蜡切片的优化工艺为：FAA固定液固定 → 盐酸溶液浸泡软化处理12 h → 2 h分级脱水 → 1 h分级透明 → 2/3二甲苯、1/3石蜡 (熔点54 ℃)，45 ℃烘箱过夜 → 1/3二甲苯、2/3石蜡 (熔点54 ℃)，50 ℃烘箱3 h，→ 纯石蜡 (60 ℃)，65 ℃烘箱，每6～12 h换一次纯蜡，重复2～3 d → 烘蜡 (5～10 min)→ 纯二甲苯 (20 min，两次)→ 1/2二甲苯 + 1/2乙醇 (5 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 95%乙醇 (2 min)→ 85%乙醇 (2 min)→ 70%乙醇 (2 min)→ 1%番红 (20 min)→ 70%乙醇 (3 min)→ 85%乙醇 (3 min)→ 95%乙醇 (3 min)→ 固绿 (1 min)→ 95%乙醇 (2 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 无水乙醇 (2 min)→ 1/2二甲苯 + 1/2乙醇 (2 min)→ 纯二甲苯 (2 min，2次)。

杉木种鳞的横切面由表皮、下皮层、转输组织、维管组织系统组成。种鳞最外层为表皮细胞，细胞壁显著加厚并强烈木质化，气孔在远轴面和近轴面的表皮均有分布，保卫细胞下陷到下皮层；下皮层在表皮细胞下方，是一层矩形木质化细胞，可防止水分蒸发，还能使种鳞具有坚挺的性质；杉木种鳞与叶片不同，无栅栏组织，传输组织发达，近轴面细胞小于远轴面细胞，该组织中分布着大小不一的多个树脂道；种鳞有多个维管束，构成维管组织，木质部在近轴面，韧皮部在远轴面。

对植物组织进行石蜡切片观察前，由于不同植物的软硬程度不同，因此要对木质化严重的植物组织进行软化处理，从而使乙醇等脱水剂、二甲苯等透明剂、石蜡等能彻底进入植物组织中，才能得到较好的切片[17-18]。杉木种鳞随着球果的生长会逐渐木质化，蜡质层增厚，如对固定后的种鳞不进行软化处理，则会脱水、透明不彻底，切片时会出现粉末状碎屑，难以得到完整蜡带，因此在杉木种鳞石蜡切片的制作过程中软化处理这一环节至关重要。本研究中的乙醇甘油溶液浸泡法耗时久且效果差；经过乙二胺浸泡处理后的材料细胞容易皱缩变形；经过盐酸溶液浸泡后的种鳞能够与石蜡融合，且可以得到连续的蜡带，但盐酸腐蚀性强，对时间和浓度把握很重要。

脱水和透明是石蜡切片技术中关键的步骤。脱水时间如果过短会脱水不彻底，时间过长则使材料变硬；用二甲苯透明时，时间过长会导致材料变脆[13]，切片时材料易破碎，无法得到完整的切片。本研究参照权金娥等[11]对四倍体刺槐茎段组织石蜡切片以及李谨谨等[12]对乌饭树茎段组织石蜡切片过程中脱水和透明方法，对杉木种鳞脱水和透明时间优化处理：50%乙醇 (2 h)→ 70%乙醇 (过夜)→ 85%乙醇 (2 h)→ 90%乙醇 (2 h)→ 95%乙醇 (2 h)→无水乙醇 (1 h, 2次)，可将材料彻底脱水；透明时间为每级1 h，且透明过程逐级细分为5步：V(无水乙醇)∶V(二甲苯)=3∶1 (1 h)→V(无水乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1 (1 h)→V(无水乙醇)∶V(二甲苯)=1∶3 (1 h)→纯二甲苯 (1 h, 2次)，既不会使材料变脆，又能很好的达到透明效果。

浸蜡这一环节在石蜡切片工艺中同样重要，浸蜡对蜡质、浸蜡次数及时间的选择均有关。本研究先选择低熔点石蜡，再选择高熔点石蜡，从低温到高温顺序进行，使石蜡慢慢渗入到组织内而将二甲苯替代出来。延长浸蜡时间、提高浸蜡温度、采取多次添加的方法，可有利于石蜡与材料充分融合，切出完整蜡带。

在染色过程中，选用番红固绿染色最为常见[19]。传统番红固绿染色常会出现番红或固绿不上色现象，耗时久、效果差。本实验根据杉木种鳞木质化严重的问题，用番红着色，并采用改良版番红染色剂，大大缩短了番红染色时间，20 min即可保证番红能很好的着色，并通过镜检有效延长或缩短后续洗色时间；固绿着色快，一般30 s即可，可通过镜检判断染色深浅来适当缩短或延长时间，从而得到染色效果较好的切片。

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