钟花樱花粉离体萌发培养及低温保存技术研究

聂超仁 况红玲 于静亚 胡文洪

(1. 武汉市园林科学研究所，湖北 武汉 430081 ；2. 武汉法雅园林集团有限公司，湖北 武汉 430081；3. 武汉市青山公园，湖北 武汉 430081)

钟花樱 (Cerasuscampanulata)，又称福建山樱花、寒绯樱、绯寒樱，属蔷薇科 (Rosea) 樱属 (Cerasus)，是我国原产的优良樱花种类，主要分布在我国东南沿海的福建、广东、广西、台湾等省和地区，日本也有分布，以福建和台湾为分布中心。其花期较早，一般在冬末春初的2月中下旬，先花后叶，花下垂如钟状，盛花期开花繁密，花色玫红色，色彩艳丽[1-2]。近几年来，随着乡土植物开发利用热潮的兴起，钟花樱因其独特的观赏价值受到越来越多的关注，开展钟花樱的杂交育种是开发利用我国樱花野生资源的有效方法和手段[3]。

在杂交育种中，为了保证授粉成功，在授粉前必须进行花粉活力测定，因此掌握准确可靠的花粉活力的测定方法就显得尤为重要。同时，由于在杂交育种中亲本花期不遇，异地授粉等情况也是客观存在的，所以在进行杂交育种之前进行花粉活力测定方法和花粉保存进行实验也是十分必要的。

花粉活力常用的测定方法有萌发法、无机酸法和染色法3类[4]。目前，樱花花粉活力测定方法的研究较少，只有同属的樱桃 (Cerasuspseudocerasus)、欧洲甜樱桃 (Cerasusavium) 等花粉活力测定方法的研究[4-5]，离体萌发法测定花粉活力被认为是和花粉体内萌发率最为接近的花粉检测方法。本研究以钟花樱为研究对象，在前人研究基础上，对离体萌发法检测花粉活力的培养基成分、培养时间进行改良试验，以期找出钟花樱花粉萌发法检测活力最佳的培养基成分、浓度组合及培养时间。

花粉的保存温度是影响花粉活力的主要因素[6]，一般情况下，低温环境有利于保持花粉生活力，目前关于樱花花粉低温保存的研究鲜有研究。本实验将采集到的新鲜花粉，经过简单处理后分别置于4、-20、-80 ℃ 3种低温环境下保存，定期检测其花粉萌发状况，对3种低温环境保持花粉活力的效果进行比较，为后期开展杂交育种工作提供技术准备。

1 材料与方法

1.1 材料来源

所选用的钟花樱花粉采集于武汉市园林科学研究所安山中试基地，实验仪器包括：新苗QHX-300BSH-Ⅱ人工气候箱，UY203i荧光显微镜，佳能D70相机等。

1.2 研究方法

1.2.1花粉收集

2016年2—3月，采集大苞期钟花樱花朵带回实验室，取出花药后，放在牛皮纸上自然散粉24 h，收集散出的花粉分装在2 mL离心管中置于冰箱中低温冷藏 (4 ℃) 待用。

1.2.2花粉离体培养

采用液体培养法，根据实验设计配制不同的培养基，培养时用胶头滴管吸取2～3滴培养基滴在凹型载破片的凹槽中，然后用镊子夹取适量花粉于培养基中，并让其充分散开，把载玻片置于250 mL培养皿中22 ℃人工气候箱中培养。培养4 h后再显微镜下观察，每个处理观察25个视野，重复3次，花粉管长度大于花粉直径的花粉算作萌发，计算萌发率。

(1)

1.2.3实验设计

蔗糖、硼酸及氯化钙单因子实验：蔗糖质量浓度梯度为0、 1%、 5%、 10%、 15%、 20%、 25%、 30%，其他2种培养基成分为硼酸10 mg/L + 氯化钙100 mg/L；硼酸的质量浓度梯度为0、10、50、100、200、500 mg/L，其他2种培养基成分浓度为蔗糖15% + 氯化钙100 mg/L；氯化钙的浓度梯度分别为0、100、150、300、500 mg/L，其他2种培养基成分的浓度为蔗糖15% + 硼酸10 mg/L；以上3个实验培养条件是22 ℃条件下，人工气候箱中培养4 h。

蔗糖、硼酸及氯化钙三因子正交试验：在单因子试验的基础上，进行L16(43) 正交试验 (表1)。 数据使用SPSS 12.0进行处理，采用非参数检验方法进行正态分布检验，并验证方差是否具有齐次性，若数据有齐次性即采用Duncan方差分析法进行处理，并进行差异性比较。

在培养时间实验中，培养基成分为蔗糖15% + 硼酸50 mg/L + 氯化钙150 mg/L，在22 ℃条件下，在人工气候箱中分别培养1、2、4、6、8 h后检测活力。

表1 培养基配方正交设计Table 1 The orthogonal design of medium formula

1.2.4花粉低温保存实验

将采集的花粉分装在2 mL的圆底离心管中，盖紧盖子装于塑料封口袋中，分别放在4、-20、-80 ℃ 3种冰箱中冷藏和冷冻。在保存0、30、60、90、150、270 d后，进行花粉活力检测，活力检测方法采用离体萌发法，培养基为实验筛选出的最优培养基，培养时间为4 h，每个处理观察25个视野，每个处理重复3次。

1.2.5数据分析及分析

采用SAS V 8.0及Excel 2007软件处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 蔗糖、硼酸及氯化钙对钟花樱花粉活力的影响

2.1.1蔗糖浓度对樱花花粉萌发的影响

蔗糖浓度对花粉萌发率的影响实验结果见图1。由图1可知，当蔗糖质量浓度在0～30%的范围内时，钟花樱花粉离体培养的萌发率呈现先升后降的趋势。蔗糖质量浓度为0时，花粉萌发率为0，这表明蔗糖是钟花樱花粉萌发的必要条件，蔗糖质量浓度过高，则抑制了钟花樱花粉的萌发，蔗糖质量浓度为15%时萌发率最高，达到57.69%，通过方差分析与多重比较表明，蔗糖质量浓度在15%和20%时花粉萌发率没有显著差异，所以蔗糖质量浓度在15%～20%范围内都最有利于花粉萌发。

不同字母表示差异显著。

图1蔗糖质量浓度对花粉萌发率的影响
Fig.1 The effects of sucrose concentration on pollen germination rate

2.1.2硼酸质量浓度对樱花花粉萌发的影响

硼酸质量浓度对花粉萌发的影响实验结果见图2。由图2可知，随着硼酸质量浓度的增加，花粉萌发率呈现先升高后下降，最后基本不变的趋势，硼酸质量浓度为0的时候萌发率最低为1.97%，说明硼酸并非钟花樱花粉萌发的必要条件，硼酸浓度过高会抑制花粉萌发。当硼酸质量浓度为50、100 mg/L时萌发率最高，分别为53.55%和52.36%。通过多重比较与差异性分析可以看出，虽然二者在0.05水平上并无显著性差异，但与其他处理存在显著差异 (P< 0.05)。可见50～100 mg/L的硼酸都是钟花樱萌发的最适浓度。

不同字母表示差异显著。

图2硼酸质量浓度对花粉萌发的影响
Fig.2 The effects of boric acid concentration on pollen germination rate

2.1.3氯化钙质量浓度对樱花花粉萌发的影响

氯化钙质量浓度对花粉萌发的影响实验结果见图3。由图3可知，钟花樱的花粉萌发率随氯化钙质量浓度先升高后下降，氯化钙浓度为0时，花粉萌发率为2%，说明氯化钙不是钟花樱花粉萌发的必要条件。氯化钙质量浓度过高会抑制花粉萌发，氯化钙质量浓度在300 mg/L是花粉萌发率达到最高53.03%，其次是150 mg/L时，达到52.25%。通过方差分析表明，虽然二者无显著性差异，但与其他3个处理存在显著差异 (P< 0.05)，可见150～300 mg/L是其花粉萌发的最适浓度范围。

不同字母表示差异显著。

图3氯化钙质量浓度对花粉萌发的影响
Fig.3 The effects of calcium chloride concentration on pollen germination rate

2.2 蔗糖、硼酸及氯化钙三因子正交实验结果

在单因子试验的基础上，确立蔗糖、硼酸和氯化钙的质量浓度范围及梯度，进一步进行L16(43) 正交实验，寻求最佳的培养基配方，正交实验结果见表2。由表2可知，钟花樱花离体培养在蔗糖100 g/L + 硼酸50 mg/L + 氯化钙100 mg/L培养基配方下花粉萌发率最高，极差分析显示各因素主次顺序依次为蔗糖、硼酸、氯化钙。

表2 蔗糖、硼酸及氯化钙三因子正交实验结果Table 2 The results of orthogonal test of 3 factors of sucrose, boric acid and calcium chloride

2.3 离体培养时间对樱花花粉活力的影响

培养时间对花粉萌发率的影响实验结果见图4。由图4可知，钟花樱离体培养的培养时间从1～8 h对花粉萌发率没有显著性影响，但是从实验中观察到，培养时间越长，花粉管会越长，相互缠绕，交织在一起，不利于观察计数。

不同字母表示差异显著。

图4培养时间对花粉萌发率的影响
Fig.4 The effects of culturing time on pollen germination rate

2.4 低温保存对花粉活力的影响

由3种低温条件下保存花粉萌发率变化情况 (见图5) 可知，钟花樱在3种低温条件下保存，随着保存时间的增加，花粉萌发率不断下降，在第270天后检测时全部失去活力；4 ℃的低温冷藏花粉失活最快，第30天检测时萌发率就从60%降到0，而此时，-20 ℃和-80 ℃条件下花粉的萌发率分别为36.63%和64%，下降了43.64%和4.84%；第150天检测时，20 ℃和-80 ℃条件下保存的花粉萌发率分别是28.3%和45.19%，与收集时相比分别下降了51.97%和23.65%；第270天时检测3种保存环境花粉活力均为0，完全失去活力。

图53种低温条件下保存花粉萌发率变化
Fig.5 The changes of pollen germination rate under 3 kinds of cryopreservations

3 结论与讨论

钟花樱花粉离体萌发法最适培养基配方为蔗糖15% + 硼酸50 mg/L + 氯化钙100 mg/L。4 ℃低温冷藏只能用于临时保存花粉，-20、-80 ℃条件下冷冻保存，可用于花粉的短期 (6个月) 保存，其中-80 ℃保存效果优于-20 ℃。降低保存温度能延长钟花樱花粉保存时间，在4 ℃的保存环境条件下，保存30 d时检测花粉就完全失去活力； -20、-80 ℃的低温保存均可用于钟花樱150 d以内的花粉保存。

在单因素实验中，适当质量浓度的蔗糖能促进花粉萌发，随着蔗糖质量浓度的增加，花粉萌发率不断增加，当蔗糖质量浓度过高时，花粉萌发率开始下降，这可能是因为适当质量浓度的蔗糖能维持花粉与培养基之间的渗透平衡，过高的蔗糖质量浓度会导致花粉管破裂产生质壁分离现象，造成原生质体脱水，致使花粉不能萌发[7-8]。单因素试验表明，不同质量浓度硼酸对钟花樱花粉萌发的影响差异显著，适宜质量浓度的硼酸可促进花粉萌发，过高的质量浓度则使花粉萌发率下降。硼酸在植物体内的含量很低，主要存在于花中的子房和柱头[9]，其在花粉萌发中的主要作用是增加糖的吸收、转运和代谢，促进构成花粉管壁的成分果胶物的合成[10]。一般情况下，花粉中的硼含量是不足的，需要柱头和花柱中的硼来补充，因此在离体培养中需要添加一定量的硼酸[11]。另外，氯化钙对钟花樱花粉萌发有显著影响。适宜质量浓度的氯化钙促进花粉萌发，过高质量浓度抑制其花粉萌发。有研究认为[12-14]，一定质量浓度的Ca2+也是花粉萌发所必需的，外源Ca2+对花粉萌发的作用取决于花粉细胞内游离钙的含量，细胞内钙充足时，添加钙可能造成细胞Ca2+中毒，以及过高的细胞膨压抑制花粉的萌发及花粉管的生长。本实验中Ca2+的添加促进了钟花樱花粉的萌发，高浓度抑制了花粉的萌发与前人的研究结果基本一致。

本实验中花粉活力均在收集当天最高，3种方式保存下，花粉保存一段时间后花粉活力逐渐降低直至失去活力。降低保存温度能延长钟花樱花粉保存的时间，说明温度是影响花粉活力的重要因素之一。有研究表明，在花粉的离体保存过程中，花粉活力降低的主要原因是呼吸基质消耗、酶失去活性、干燥损伤及代谢物阻塞等[15]。同时，花粉含水量也是影响花粉低温保存时间长短的因素，本试验在材料处理上只是在散粉时把花药置于25 ℃空调房间内自然散粉，没有考虑花粉含水量不同对花粉保存的影响，有待后续实验进一步深入研究。

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