传染性蛋白的“负面”和“正面”（6）

朱钦士 （美国南加州大学医学院）

（上接2018年第8期第18页）

2.18 酵母细胞中的传染性蛋白质 酵母在一般情况下是单细胞的真核生物，与动物相比是较“原始”的，但酵母中存在传染性蛋白的线索在半个世纪前就被发现了，比疯牛病报道的年代（1986年）还早。1965年，英国科学家Brian Cox发现，出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）的一个“突变种”中，细胞对转译终止码的识别出了问题，即肽链合成至mRNA上的转译终止码（UAG和UAA）时，转译过程并未停止，而是继续进行，好像核糖体对终止码“视而不见”。在与腺嘌呤的合成有关的一个基团发生突变（ade2-1基因突变），在编码序列中提前出现一个终止码时，在正常情况下突变型酵母是不能合成完整的酶的，因为合成过程提前终止。由于这个酶功能的缺失，腺嘌呤合成过程中的中间产物就会在细胞中聚集，使得菌斑成为红色，这个突变型酵母也必须从培养液中获得腺嘌呤才能生长。而有终止码识别问题的酵母会“忽略”此终止码，生产出完整的酶，腺嘌呤的合成正常进行，菌斑为白色（因为没有中间产物聚集），培养基里也不用添加腺嘌呤。

该终止码识别缺失的特性还可遗传，使得后代的所有酵母都拥有此特性。按照分子生物学的经典理论，负责这个性状遗传的应该是某个问题基因，即通过DNA遗传，且是“显性”（dominant）遗传，即2份基因中只要有一份基因突变，后代就可获得突变引起的性状。Cox将酵母的这个性状用希腊字母ψ标记，读音为psi。然而对遗传方式的研究结果却与预期不符。例如将变种与正常的酵母杂交，后代应该是一部分有终止码识别问题，一部分没有，但结果却是杂交的所有后代都没有终止码识别问题，好像这个突变基因又变成了“隐性”（recessive）的，即需要2份基因都发生突变才表现突变症状。即酵母该性状的遗传方式与经典的孟德尔遗传方式不同，称为“非孟德尔型遗传”（non-Mendelian heredity）。

此现象让科学家困惑了几十年，即使在1982年Prusiner提出传染性蛋白的概念之后，科学家仍然没有想到酵母的异常遗传现象可用传染性蛋白进行解释。直至1994年，美国科学家Reed B.Wickner才从传染性蛋白致病的事实中得到启发，发现了酵母的另一个性状，即在氮源利用上的机制变化，也是由传染性蛋白控制和遗传的（见下文），由此开启了酵母传染性蛋白的研究。在这之后2年，即1996年，美国的Susan Lindquist等才证明酵母的psi性状也是通过传染性蛋白遗传的。科学家用［PST+］表示此性状，其中的大写字母和正号表示“显性”，而括弧表示“非孟德尔型遗传”。没有这个psi性状的酵母则用小写字母和负号［pst-］表示。

此遗传不是通过DNA，而是通过细胞质完成的。起遗传作用的是一个称为Sup35的蛋白质改变折叠方式，变成了Prion型的结构。在正常酵母细胞中，Sup35是水溶性的，并与另一个蛋白Sup45一起，识别mRNA上的转译终止码，并将合成完成的肽链从核糖体上解离下来。类似ApoA-I蛋白能改变折叠状况的氨基端，Sup35的氨基端也能改变折叠方式，变成Prion蛋白那样的横向β-折叠，进而形成聚合物。此聚合物能结合刚果红，对聚合物的圆二色性（CD）测定表明其中富含β-折叠，说明其结构和Prion蛋白类似。这个改变了折叠方式的Sup35蛋白，像PrPsc能将PrPc改变成自己的结构一样，也能将水溶性的Sup35改变成不溶于水的聚合物，即具有“传染性”，最后使得酵母细胞中所有的Sup35都转变成为聚合物而失去功能，使细胞不再能识别转译终止码，其作用和Sup35的基因突变使Sup35蛋白丧失功能的效果是一样的。

将提纯的Sup35蛋白在体外变为聚合物，再引入［psi-］型的酵母，可将［psi-］型的酵母变为［PST+］型的酵母。当［PSI+］型的酵母与［pst-］型的酵母杂交时，［PSI+］细胞中的Sup35聚合物还会将［psi-］型酵母中的可溶性Sup35变为聚合物。不仅如此，酵母细胞中的热休克蛋白Hsp104还能将这些聚合物分为小块，在细胞中均匀分布，在细胞繁殖时进入每一个后代细胞。因此在这里，Sup35蛋白的Prion形式不仅具有“传染性”（即以可溶性Sup35蛋白为原料自我复制），它还具有“遗传性”，在所有的后代细胞中出现，好像这个遗传是“显性”的。而Sup35基因突变的遗传方式则是孟德尔型的隐性遗传（需要2份基因突变才能使正常Sup35的功能消失）。

酵母的另一个传染性蛋白是调节细胞氮代谢的蛋白Ure2p。在有优质氮源（例如氨和谷氨酰胺）时，Ure2p能抑制另一个蛋白Gln3p的作用，使得细胞在有优质氮源时不能使用低质量的氮源（例如uredosuccinate，Ure2p的名称的由来）。当Ure2p变成Prion形式，即变为没有正常功能的蛋白时，对Gln3p的抑制解除，细胞就可以在有优质氮源时也能使用低质量的氮源。酵母的这种状态被称为［URE3］。

与Sup35蛋白和ApoA-I蛋白类似，Ure2p蛋白的氨基端也较易改变折叠状况，形成Prion蛋白那样的β-折叠结构。提取的Ure2p片段（残基1～65）可在试管中迅速形成小纤维。这些小纤维能被刚果红染色，并在偏振光显微镜下呈苹果绿的双折射现象，说明与动物的传染性蛋白形成的小纤维有类似的结构。这样形成的小纤维也能使全长的Ure2p蛋白改变折叠状况，形成更粗的小纤维，说明该结构能够复制自己。［URE3］的性状是遗传性的，即可传递给下一代。此遗传也需要Hsp104的参与。

酵母［PSI+］和［URE3］性状的形成并不需要Sup35和Ure2p的基因突变，而是可以自然发生。5%的乙醇能极大增加这2个蛋白变成Prion类型蛋白的几率。这些蛋白表达水平的升高也会使Prion型蛋白出现的几率增加。与动物的传染性蛋白对细胞有伤害性不同，［PSI+］和［URE3］的性状能遗传给后代，说明Sup35和Ure2p蛋白形成的Prion型聚合物对酵母细胞的害处并不大，甚至有人认为酵母中传染性蛋白的形成，也许是酵母在不改变基因的DNA序列的情况下适应某些不利生活条件的一种方法。

除Sup35和Ure2p蛋白，酵母的其他一些蛋白也可转变为Prion型的结构，所以也属于酵母的传染性蛋白，例如转录调节因子Mot3（modulator of transcription）可形成［MOT3+］，修改酵母转移RNA（tRNA）的蛋白Mod5（tRNA modification）可形成［MOD+］，改变酵母染色质的蛋白SwiI可形成［SWI+］等。这些蛋白折叠方式的改变也导致酵母性状的改变。

检查酵母传染性蛋白的氨基酸序列，发现容易形成Prion型结构的功能域含有较多的谷氨酰胺和天冬酰胺残基，而少有带电的氨基酸侧链。将功能域中的氨基酸序列打乱，随机排列，功能域仍具有形成Prion型结构的能力，说明不是具体的氨基酸序列，而是氨基酸的组成，是决定一段肽链是否容易（或者能够）形成Prion型结构的因素。造成人类杭廷顿氏症的Huntingtin基因，就是增加了很多CAG重复序列，相当于在蛋白中增加了许多谷氨酰胺残基，使其转变为Prion型结构的可能性极大增加。

但不是所有的Prion型功能域都富含谷氨酰胺和天冬酰胺。例如引起阿茨海默症的Aβ肽链就不富含这2种氨基酸，在42个氨基酸残基中只含有1个谷氨酰胺和1个天冬酰胺残基，且不少氨基酸残基的侧链含有带电基团。即使酵母的传染性蛋白Mod5也没有富含这2种氨基酸的功能域，说明其他氨基酸组成的肽链区段也可能有形成Prion型结构的能力。但是富含谷氨酰胺和天冬酰胺的特点，还是可以代表一部分传染性蛋白的功能域，可用于搜寻其他蛋白中类似的功能域。在此思想指导下，Susan Lindquist编写了用氨基酸组成预测肽链变为Prion型结构的程序，可用于检测其他生物中的蛋白是否也含有类似的功能域。用该程序，科学家在细菌中也发现了传染性蛋白。

2.19 肉毒杆菌中的传染性蛋白Rho（ρ）如上所说，许多传染性蛋白都有自己形成Prion型结构的功能域，其中一些（特别是酵母的传染性蛋白）富含谷氨酰胺和天冬酰胺。2017年，美国科学家Ann Hochschild用酵母的传染性蛋白为模板，搜寻约6万个细菌的基因组，发现肉毒杆菌（Clostridium botulinum）的Rho（代表希腊字母ρ）蛋白含有这样的功能域（在残基74～141）。

Rho蛋白，类似酵母的Sup35蛋白，也是负责终止基因表达的蛋白。Sup35的功能是与Sup45一起识别转译终止码，使核糖体停止肽链的合成过程，并将新合成的肽链从核糖体释放出来；而Rho蛋白以六聚体的形式，结合在新合成mRNA分子上，停止转录并释放新合成的mRNA分子。

为证明此功能域确实能形成Prion型的结构，Hochschild将 Rho的74～141片段、1～248片段（其中包含74～141片段），以及残基1～73被除去的Rho片段（也含有74～141片段）表达在大肠杆菌中，结果发现这3个片段都能形成Prion型的聚合物。这些聚合物能结合刚果红，并在偏振光显微镜上呈现苹果绿色的双折射现象。相反，不含此功能域的Rho蛋白片段（例如残基1～141被去掉），则不形成这样的聚合物。

Rho蛋白变成Prion型的结构后，理论上它终止转录过程的功能也应消失。为证明这一点，Hochschild利用在大肠杆菌中的基因表达系统，将Rho的Prion功能域与大肠杆菌Rho蛋白的羧基端相连接，再观察对“报告基因”（受某个启动子操控，表达产物容易检测的基因）表达的影响。结果表明，大肠杆菌会有2种状态，报告基因高表达的状态和低表达状态，说明这样的杂合Rho蛋白有2种功能状态。从这2种大肠杆菌中提取的Rho蛋白表明，低表达细菌中的Rho处于聚合物的状态，而高表达的Rho蛋白处于可溶状态。

不仅如此，2种表达状态不同的大肠杆菌还能以低概率相互转化，说明Rho蛋白可在聚合状态和可溶状态间相互转化。聚集状态可长期在大肠杆菌中维持，在传120代之后仍然保持聚集状态，说明细菌的Rho蛋白不仅具有传染性，且与酵母一样具有遗传性。

由于Rho蛋白是以酵母富含谷氨酰胺和天冬氨酸残基的功能域为模板搜寻到的，细菌很可能还含有其他氨基酸残基组成的功能域，例如像人类PrP蛋白的功能域和Aβ肽链那样的功能域。

传染性蛋白在细菌中被发现，说明形成Prion型结构的蛋白功能域出现的时间非常之早，在原核生物和真核生物分开之前就发生了。传染性蛋白改变折叠方式，进而聚合而丧失功能，也许是微生物适应严酷环境的一种方式。例如Sup35和Rho蛋白变成Prion形式后，原来转录和转译的功能消失，造成更长的mRNA和肽链的形成，在mRNA的稳定性和蛋白的功能上都会发生改变，在一些环境条件下对生物的生存可能是有利的。这种方式不需要基因发生突变，而又能传递给后代，因此是对微生物有利的机制而得以保存。这种遗传方式不同于通过DNA的基因遗传，而是通过细胞质中蛋白质的遗传。从这些蛋白质的传染性（复制自己的结构）和遗传性（能通过聚合物的形式传给后代）这2个方面来看，蛋白质里储存的信息是可以被输出的。

2.20 植物中的传染性蛋白 使用自己编写的搜寻Prion型功能域的程序，Lindquist搜寻了植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的基因组，发现了474个拟南芥蛋白含有类似的Prion型的功能域。其中的3个蛋白与拟南芥开花控制有关，分别是LD（luminidependens）、FPA（Flowering Locus PA)和FCA（Flowering Locus CA）。其中LD是一个转录因子，FPA和FCA是RNA结合蛋白。

为证明这些功能域的确能形成Prion类型的结构，Lindquist将这些功能域与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）融合在一起，在酵母中进行表达，发现这3个功能域都能形成淀粉样聚合物。

将这3个功能域与酵母Sup35蛋白的羧基端融合在一起，在有Ade基因突变（即在编码区中提前引入一个转译终止码）的酵母中表达，发现它们能在部分酵母中使Sup35的羧基端丧失功能，使酵母能忽略该终止码，合成完整的蛋白，说明这些功能域的确能发挥Prion结构的作用，即使可溶性的蛋白丧失功能。有些酵母仍然不能忽略终止码，说明有部分Sup35羧基端仍处于功能状态，不因为与植物的Prion功能域融合就丧失功能，即植物蛋白的Prion功能域在酵母中也不完全形成Prion型的结构。

同样，由于这几个蛋白是以酵母富含谷氨酰胺和天冬氨酸残基的功能域为模板搜寻到的，植物很可能还含有其他氨基酸残基组成的功能域。目前对植物传染性蛋白的研究还很少，估计随着研究的进展，会有更多的植物传染性蛋白被发现。

2.21 传染性蛋白有“光明面”吗 从以上例子可以看出，蛋白肽链的折叠出现错误，形成Prion型的横向β-折叠结构，进而聚集形成淀粉样沉积，是肽链在折叠过程中不可避免地要出现的问题。生物既然选择了用氨基酸组建蛋白质，就不能完全避免折叠状态出问题的可能性。Prion型的结构就像是一个“折叠陷阱”，一旦掉入此结构，就很难再出来。不仅如此，开始形成的聚合物就像一个“黑洞”，不断将周围正常的蛋白“吸”入自己的结构，让自己长大，使得这种结构的蛋白具有传染性。

在形成Prion型的结构时，由于蛋白分子的结构改变，通常都会导致蛋白质原先正常的生理功能丧失。不仅如此，在人和其他高等动物中，淀粉样的沉积物，无论是在细胞内还是在细胞外，几乎对细胞都是有害的，导致各式各样的淀粉样变性病。现在一提到传染性蛋白，人们想到的都是它造成的可怕后果，即蛋白折叠方式改变所造成的后果总是负面的。Prion被译为“朊病毒”，和疾病传染源划归一类，就反映了这种情况。即使在酵母中，［PSI+］和［URE3］也被一些科学家看作是传染性蛋白病。由于许多医院并不进行淀粉样病变的检测工作（例如对需要透析和换肾的患者并不进行淀粉样沉积的检查），淀粉样变性病的实际发生率估计要比已报道的为多。不过总的说来，淀粉样变性病的发病率还是很低的，动物亿万年的演化，已最大限度地减少了蛋白折叠错误及其带来的不良后果，现在发现的淀粉样变性病，是动物对肽链折叠错误的各种防御机制在一些情况下不可避免的失效所造成的结果。

现在的问题是，蛋白折叠错误的后果总是负面的，是否还是有其“光明面”？近年来的科学研究表明，蛋白形成淀粉样聚合物不仅有致病作用，也有正面效果。在本文的第3部分中，将详细介绍淀粉样聚合物的“正面作用”，即它们的生理功能。

（待续）